1 材料

　　1.1 蜂膠提取物取本地產(chǎn)蜂膠，冰凍粉碎后以95%乙醇浸泡72 h，過(guò)濾，濾液于40℃減壓揮干溶劑，二甲基亞砜（DMSO）溶解定容為2 mg/ml。

　　1.2 試劑及儀器RPMI1640培養(yǎng)液為美國(guó)GIBCO公司產(chǎn)品；FACSCalibur流式細(xì)胞儀為美國(guó)BECTON DICKINSON公司產(chǎn)品；POD試劑盒購(gòu)自華美生物工程公司；MRC-1024激光共聚焦顯微鏡（BIO-RAD公司產(chǎn)品）。

　　1.3 細(xì)胞株人喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞株由白求恩國(guó)際和平醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

　　2 方法

　　2.1 蜂膠濃度分組實(shí)驗(yàn)前用RPMI1640（Gibco公司）將蜂膠提取物稀釋成20，40，80，160 μg/ml，DMSO的濃度低于0.02%。

　　2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)收集對(duì)照組和80 μg/ml蜂膠作用不同時(shí)間（24，48，72 h）的細(xì)胞，用PBS洗滌2遍，經(jīng)檸檬酸緩沖液固定1 h以上，上機(jī)前加1 800 μl胰酶消化液充分作用，加入1 500 μl碘化丙啶（PI）作用15 min以上，過(guò)濾，上機(jī)進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析和細(xì)胞周期分析。

　　2.3 原位末端標(biāo)記法（TUNEL）定量檢測(cè)分別于各劑量藥物作用后24，48，72 h收集細(xì)胞，PBS洗2次，細(xì)胞涂片，室溫干燥。按原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，用普通光鏡計(jì)算凋亡率（AI）。計(jì)算方法：隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，分別計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及總細(xì)胞數(shù)，代入下式：AI=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

　　2.4 Hep-2細(xì)胞內(nèi)Ca2+變化的激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hep-2細(xì)胞，用D-Hanks液洗滌2次，于37℃避光條件下Fluo-3/AM（10 μmol/L）荷載。40 min后用D-Hanks液洗滌細(xì)胞3次，洗去細(xì)胞外殘余染料，最后保留少許細(xì)胞外D-Hanks緩沖液，平衡10 min。經(jīng)不同濃度蜂膠作用不同時(shí)間，在激光共聚焦顯微鏡下掃描細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)526 nm，以本底熒光強(qiáng)度為參照（0），檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度。

　　2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料用±s表示，比較時(shí)采用t檢驗(yàn)。α=0.050。

　　3 結(jié)果

　　3.1 流式細(xì)胞儀檢查結(jié)果80 μg/ml蜂膠對(duì)Hep-2細(xì)胞凋亡率的影響：24，48，72 h時(shí)Hep-2細(xì)胞抑制率分別為36.2%，44.5%，58.6%，時(shí)間越長(zhǎng)細(xì)胞凋亡率越高（P<0.05）。24，48，72 h時(shí)G0/G1期細(xì)胞分別占67.2%，55.8%，59.4%；S期分別占19.1%，28.3%，33.5%；G2/M期分別占13.7%，15.9%，7.1%。

　　3.2 TUNEL標(biāo)記各組細(xì)胞凋亡率明顯升高，與同時(shí)間對(duì)照組比較差異有顯著性，且呈現(xiàn)一定的時(shí)間、劑量依賴(lài)性。與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01，各時(shí)間組、各劑量組相關(guān)系數(shù)r經(jīng)檢驗(yàn)，P<0.013.3 Hep-2細(xì)胞內(nèi)Ca2+的變化結(jié)果見(jiàn)表2。隨藥物濃度的增加，不同濃度組之間的細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度亦增高。P<0.05。

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