專題1、2選修一生物技術(shù)實踐 知識點總結(jié)

高中生物選修一生物技術(shù)實踐知識點總結(jié)

專題一傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)的應(yīng)用課題一果酒和果醋的制作

1、發(fā)酵：通過微生物技術(shù)的培養(yǎng)來生產(chǎn)大量代謝產(chǎn)物的過程。

2、有氧發(fā)酵：醋酸發(fā)酵谷氨酸發(fā)酵無氧發(fā)酵：酒精發(fā)酵乳酸發(fā)酵

3、酵母菌是兼性厭氧菌型微生物真菌酵母菌的生殖方式：出芽生殖(主要)分裂生殖孢子生殖4、在有氧條件下，酵母菌進行有氧呼吸，大量繁殖。C6H12O6＋6O2＋6H2O→6CO2＋12H2O+能量5、在無氧條件下，酵母菌能進行酒精發(fā)酵。C6H12O6→2C2H5OH＋2CO2+能量6、20℃左右最適宜酵母菌繁殖酒精發(fā)酵時一般將溫度控制在18℃-25℃

7、在葡萄酒自然發(fā)酵的過程中,起主要作用的是附著在葡萄皮表面的野生型酵母菌.在發(fā)酵過程中,隨著酒精濃度的提高,紅葡萄皮的色素也進入發(fā)酵液,使葡萄酒呈現(xiàn)深紅色.在缺氧呈酸性的發(fā)酵液中，酵母菌可以生長繁殖，而絕大多數(shù)其他微生物都因無法適應(yīng)這一環(huán)境而受到制約。

8、醋酸菌是單細胞細菌(原核生物),代謝類型是異養(yǎng)需氧型,生殖方式為二分裂

9、當(dāng)氧氣、糖源都充足時，醋酸菌將葡萄汁中的糖分解成醋酸；當(dāng)缺少糖源時，醋酸菌將乙醇變?yōu)橐胰�，再將乙醛變�(yōu)榇姿帷?/p>

C6H12O6＋2O2→2CH3COOH＋2CO2＋2H2OC2H5OH＋O2→CH3COOH＋H2O

10、控制發(fā)酵條件的作用①醋酸菌對氧氣的含量特別敏感，當(dāng)進行深層發(fā)酵時，即使只是短時間中斷通入氧氣，也會引起醋酸菌死亡。②醋酸菌最適生長溫度為32℃，控制好發(fā)酵溫度，使發(fā)酵時間縮短，又減少雜菌污染的機會。③有兩條途徑生成醋酸：直接氧化和以酒精為底物的氧化。

11、實驗流程：挑選葡萄→沖洗→榨汁→酒精發(fā)酵→果酒（→醋酸發(fā)酵→果醋）

12、酒精檢驗：果汁發(fā)酵后是否有酒精產(chǎn)生，可以用重鉻酸鉀來檢驗。在酸性條件下，重鉻酸鉀與酒精反應(yīng)呈現(xiàn)灰綠色。先在試管中加入發(fā)酵液2ｍL，再滴入物質(zhì)的量濃度為3mol/L的H2SO43滴，振蕩混勻，最后滴加常溫下飽和的重鉻酸鉀溶液3滴，振蕩試管，觀察顏色

13、充氣口是在醋酸發(fā)酵時連接充氣泵進行充氣用的；排氣口是在酒精發(fā)酵時用來排出二氧化碳的；出料口是用來取樣的。排氣口要通過一個長而彎曲的膠管與瓶身相連接，其目的是防止空氣中微生物的污染。開口向下的目的是有利于二氧化碳的排出。使用該裝置制酒時，應(yīng)該關(guān)閉充氣口；制醋時，應(yīng)該充氣口連接氣泵，輸入氧氣。疑難解答

（1）你認為應(yīng)該先沖洗葡萄還是先除去枝梗？為什么？

應(yīng)該先沖洗，然后再除去枝梗，以避免除去枝梗時引起葡萄破損，增加被雜菌污染的機會。（2）你認為應(yīng)該從哪些方面防止發(fā)酵液被污染？

如：要先沖洗葡萄，再除去枝梗；榨汁機、發(fā)酵裝置要清洗干凈，并進行酒精消毒；每次排氣時只需擰松瓶蓋，不要完全揭開瓶蓋等。

（3）制葡萄酒時，為什么要將溫度控制在18～25℃？制葡萄醋時，為什么要將溫度控制在30～35℃？

溫度是酵母菌生長和發(fā)酵的重要條件。20℃左右最適合酵母菌的繁殖。因此需要將溫度控制在其最適溫度范圍內(nèi)。而醋酸菌是嗜溫菌，最適生長溫度為32℃，因此要將溫度控制在30～35℃。

課題二腐乳的制作

1、多種微生物參與了豆腐的發(fā)酵，如青霉、酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。毛霉是一種絲狀真菌。代謝類型是異養(yǎng)需氧型。生殖方式是孢子生殖。營腐生生活。

2、原理：毛霉等微生物產(chǎn)生的蛋白酶能將豆腐中的蛋白質(zhì)分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可將脂肪水解為甘油和脂肪酸。3、實驗流程：讓豆腐上長出毛霉→加鹽腌制→加鹵湯裝瓶→密封腌制4、釀造腐乳的主要生產(chǎn)工序是將豆腐進行前期發(fā)酵和后期發(fā)酵。

前期發(fā)酵的主要作用：1.創(chuàng)造條件讓毛霉生長。2.使毛酶形成菌膜包住豆腐使腐乳成型。

后期發(fā)酵主要是酶與微生物協(xié)同參與生化反應(yīng)的過程。通過各種輔料與酶的緩解作用，生成腐乳的香氣。

5、將豆腐切成3cm×3cm×1cm的若干塊。所用豆腐的含水量為70％左右，水分過多則腐乳不易成形。*水分測定方法如下：精確稱取經(jīng)研缽研磨成糊狀的樣品5～10g(精確到0.02mg)，置于已知重量的蒸發(fā)皿中，均勻攤平后，在100～105℃電熱干燥箱內(nèi)干燥4h，取出后置于干燥器內(nèi)冷卻至室溫后稱重，然后再烘30min，直至所稱重量不變?yōu)橹埂�樣品水分含量�?）計算公式如下：

(烘干前容器和樣品質(zhì)量-烘干后容器和樣品質(zhì)量)/烘干前樣品質(zhì)量

毛霉的生長：條件:將豆腐塊平放在籠屜內(nèi)，將籠屜中的控制在15～18℃，并保持一定的濕度。

來源：1.來自空氣中的毛霉孢子，2.直接接種優(yōu)良毛霉菌種時間：5天

加鹽腌制：將長滿毛霉的豆腐塊分層整齊地擺放在瓶中，同時逐層加鹽，隨著層數(shù)的加高而增加鹽量，接近瓶口表面的鹽要鋪厚一些。加鹽腌制的時間約為8天左右。

用鹽腌制時，注意控制鹽的用量：鹽的濃度過低，不足以抑制微生物的生長，可能導(dǎo)致豆腐腐敗變質(zhì)；鹽的濃度過高會影響腐乳的口味

食鹽的作用：1.抑制微生物的生長，避免腐敗變質(zhì)2.析出水分，使豆腐變硬，在后期制作過程中不易酥爛3.調(diào)味作用，給腐乳

以必要的咸味4.浸提毛酶菌絲上的蛋白酶。

配制鹵湯：鹵湯直接關(guān)系到腐乳的色、香、味。鹵湯是由酒及各種香辛料配制而成的。鹵湯中酒的含量一般控制在12%左右。

酒的作用：1.防止雜菌污染以防腐2.與有機酸結(jié)合形成酯，賦予腐乳風(fēng)味3.酒精含量的高低與腐乳后期發(fā)酵時間的長短有很大關(guān)系，酒精含量越高，對蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延長；酒精含量過低，蛋白酶的活性高，加快蛋白質(zhì)的水解，雜菌繁殖快，豆腐易腐敗，難以成塊。

香辛料的作用：1.調(diào)味作用2.殺菌防腐作用3.參與并促進發(fā)酵過程

防止雜菌污染：①用來腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干凈后要用沸水消毒。②裝瓶時，操作要迅速小心。整齊地擺放好豆腐、加入鹵湯后，要用膠條將瓶口密封。封瓶時，最好將瓶口通過酒精燈的火焰，防止瓶口被污染。疑難解答

（1）利用所學(xué)的生物學(xué)知識，解釋豆腐長白毛是怎么一回事？

豆腐生長的白毛是毛霉的白色菌絲。嚴格地說是直立菌絲，在豆腐中還有匍匐菌絲。（2）為什么要撒許多鹽，將長毛的豆腐腌起來？鹽能防止雜菌污染，避免豆腐腐敗。

（3）我們平常吃的豆腐，哪種適合用來做腐乳？

含水量為70%左右的豆腐適于作腐乳。用含水量高的豆腐制作腐乳，不易成形。

（4）吃腐乳時，你會發(fā)現(xiàn)腐乳外部有一層致密的“皮”。這層“皮”是怎樣形成的呢？它對人體有害嗎？它的作用是什么？“皮”是前期發(fā)酵時在豆腐表面上生長的菌絲（匍匐菌絲），對人體無害。它能形成腐乳的“體”，使腐乳成形。

課題三制作泡菜

制作泡菜所用微生物是乳酸菌，其代謝類型是異養(yǎng)厭氧型。在無氧條件下，將糖分解為乳酸。分裂方式是二分裂。反應(yīng)式為：

C酶6H12O62C3H6O3+能量含抗生素牛奶不能生產(chǎn)酸奶的原因是抗生亞素殺死乳酸菌。常見的乳酸菌有乳酸鏈球菌和乳酸桿菌。乳酸桿菌常用于生產(chǎn)酸奶。硝亞硝酸鹽為白色粉末，易溶于水，在食品生產(chǎn)中用作食品添加劑。

酸膳食中的亞硝酸鹽一般不會危害人體健康，國家規(guī)定肉制品中不超過30mg/kg，鹽醬腌菜中不超過20mg/kg，嬰兒奶粉中不超過2mg/kg。亞硝酸鹽被吸收后隨尿液含排出體外，但在適宜pH、溫度和一定微生物作用下形成致癌物質(zhì)亞硝胺。

量一般在腌制10天后亞硝酸鹽含量開始降低，故在10天之后食用最好測定亞硝酸鹽含量的方法是：比色法

發(fā)酵時間（d）原理是在鹽酸酸化條件下，亞硝酸鹽與對基苯磺酸發(fā)生重氮化反應(yīng)后，與N-1-萘基乙二胺鹽酸鹽結(jié)合形成玫瑰紅色染料，與已知濃度的標準顯色液目測比較，估算泡菜中亞硝酸鹽含量。專題二微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用課題一微生物的實驗室培養(yǎng)

培養(yǎng)基：人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)，是進行微生物培養(yǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。

培養(yǎng)基按照物理性質(zhì)可分為液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑瓊脂（是從紅藻中提取的一種多糖，在配制培養(yǎng)基中用作凝固劑）后，制成瓊脂固體培養(yǎng)基。微生物在固體培養(yǎng)基表面生長，可以形成肉眼可見的菌落。根據(jù)菌落的特征可以判斷是哪一種菌。液體培養(yǎng)基應(yīng)用于工業(yè)或生活生產(chǎn)，固體培養(yǎng)基應(yīng)用于微生物的分離和鑒定，半固體培養(yǎng)基則常用于觀察微生物的運動及菌種保藏等。

按照成分培養(yǎng)基可分為人工合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基是用成分已知的化學(xué)物質(zhì)配制而成，其中成分的種類比例明確，常用于微生物的分離鑒定。天然培養(yǎng)基是用化學(xué)成分不明的天然物質(zhì)配制而成，常用于實際工業(yè)生產(chǎn)。

按照培養(yǎng)基的用途，可將培養(yǎng)基分為選擇培養(yǎng)基和鑒定培養(yǎng)基。選擇培養(yǎng)基是指在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物生長，促進所需要的微生物的生長。鑒別培養(yǎng)基是根據(jù)微生物的特點，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品配制而成的，用以鑒別不同類別的微生物。

培養(yǎng)基的化學(xué)成分包括水、無機鹽、碳源、氮源（生長因子）等。

碳源：能為微生物的代謝提供碳元素的物質(zhì)。如CO2、NaHCO3等無機碳源；糖類、石油、花生粉餅等有機碳源。異養(yǎng)微生物只能利用有機碳源。單質(zhì)碳不能作為碳源。

氮源：能為微生物的代謝提供氮元素的物質(zhì)。如N-+

2、NH3、NO3、NH4（無機氮源）蛋白質(zhì)、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨（有機氮源）等。只有固氮微生物才能利用N2。

培養(yǎng)基還要滿足微生物生長對PH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的要求。例如，培養(yǎng)乳酸桿菌時需要在培養(yǎng)基中添加維生素，培養(yǎng)霉菌時須將培養(yǎng)基的pH調(diào)至酸性，培養(yǎng)細菌是需要將pH調(diào)至中性或微堿性，培養(yǎng)厭氧型微生物是則需要提供無氧的條件無菌技術(shù)獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止外來雜菌的入侵，要注意以下幾個方面：

①對實驗操作的空間、操作者的衣著和手，進行清潔和消毒。②將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進行滅菌。③為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實驗操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進行。④實驗操作時應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。

無菌技術(shù)除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？答：無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。消毒與滅菌的區(qū)別

消毒指使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。消毒方法常用煮沸消毒法，巴氏消毒法（對于一些不耐高溫的液體）還有化學(xué)藥劑（如酒精、氯氣、石炭酸等）消毒、紫外線消毒。

滅菌則是指使用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。滅菌方法有灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌。滅菌方法：①接種環(huán)、接種針、試管口等使用灼燒滅菌法；

②玻璃器皿、金屬用具等使用干熱滅菌法，所用器械是干熱滅菌箱；③培養(yǎng)基、無菌水等使用高壓蒸汽滅菌法，所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋。

④表面滅菌和空氣滅菌等使用紫外線滅菌法，所用器械是紫外燈。

比較項理化因素的作用強度消滅微生物的數(shù)量芽孢和孢子能否被消滅消毒較為溫和部分生活狀態(tài)的微生物不能滅菌強烈全部微生物能制作牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基

（1）方法步驟：計算、稱量、溶化、滅菌、倒平板。（2）倒平板操作的步驟：

①將滅過菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁的桌面上，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手拔出棉塞。②右手拿錐形瓶，將瓶口迅速通過火焰。

③用左手的拇指和食指將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，右手將錐形瓶中的培養(yǎng)基（約10～20mL）倒入培養(yǎng)皿，左手立即蓋上培養(yǎng)皿的皿蓋。

④等待平板冷卻凝固，大約需5～10min。然后，將平板倒過來放置，使培養(yǎng)皿蓋在下、皿底在上。倒平板操作的討論

1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？

提示：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？

答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？

答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，將平板倒置，既可以防止培養(yǎng)基表面的水分過度地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。

4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？

答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。純化大腸桿菌

（1）微生物接種的方法最常用的是平板劃線法和稀釋涂布平板法。

（2）平板劃線法是通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作。將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體，這就是菌落。

（3）稀釋涂布平板法是將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進行培養(yǎng)。分為系列稀釋操作和涂布平板操作兩步。

（4）用平板劃線法和稀釋涂布平板法接種的目的是：使聚集在一起的微生物分散成單個細胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落，以便于純化菌種。（5）平板劃線法操作步驟：

①將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)燒紅。②在火焰旁冷卻接種環(huán)，并打開棉塞。③將試管口通過火焰。④將已冷卻的接種環(huán)伸入菌液中蘸取一環(huán)菌液。

⑤將試管通過火焰，并塞上棉塞。⑥左手將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。注意不要劃破培養(yǎng)皿。⑦灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一區(qū)域劃線的末端開始往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復(fù)以上操作，在三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線。注意不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連。⑧將平板倒置放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。平板劃線操作的討論

1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。

2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。

3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？

答：劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。（6）涂布平板操作的步驟：

①將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。②取少量菌液，滴加到培養(yǎng)基表面。③將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃盡后，冷卻8～10s。④用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。

涂布平板操作的討論

涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進行無菌操作？提示：應(yīng)從操作的各個細節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍；等等。菌種的保存

（1）對于頻繁使用的菌種，可以采用臨時保藏的方法。

①臨時保藏方法

將菌種接種到試管的固體斜面培養(yǎng)基上，在合適的溫度下培養(yǎng)。當(dāng)菌落長成后，將試管放入4℃的冰箱中保藏。以后每3～6個月，都要重新將菌種從舊的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基上。

②缺點：這種方法保存的時間不長，菌種容易被污染或產(chǎn)生變異。（2）對于需要長期保存的菌種，可以采用甘油管藏的方法。

在3mL的甘油瓶中，裝入1mL甘油后滅菌。將1mL培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)移到甘油瓶中，與甘油充分混勻后，放在－20℃的冷凍箱中保存。疑難解答（1）生物的營養(yǎng)

營養(yǎng)是指生物攝取、利用營養(yǎng)物質(zhì)的過程。營養(yǎng)物質(zhì)是指維持機體生命活動，保證發(fā)育、生殖所需的外源物質(zhì)。人及動物的營養(yǎng)物質(zhì)：水、無機鹽、糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、維生素六類。植物的營養(yǎng)物質(zhì)：礦質(zhì)元素、水、二氧化碳等三類。

微生物的營養(yǎng)物質(zhì)：水、無機鹽、碳源、氮源及特殊營養(yǎng)物質(zhì)五類。（2）確定培養(yǎng)基制作是否合格的方法

將未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2天，無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。

課題二土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)

尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥，尿素并不能直接被農(nóng)作物吸收。只有當(dāng)土壤中的細菌將尿素分解成氨之后，才能被植物利用。土壤中的細菌之所以能分解尿素，是因為他們能合成脲酶

尿素最初是從人的尿液中發(fā)現(xiàn)的

篩選菌株

（1）實驗室中微生物的篩選應(yīng)用的原理

人為提供有利于目的菌株生長的條件（包括營養(yǎng)、溫度、pH等），同時抑制或阻止其他微生物生長。（2）選擇性培養(yǎng)基

在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，稱作選擇培養(yǎng)基。（3）配制選擇培養(yǎng)基的依據(jù)

根據(jù)選擇培養(yǎng)的菌種的生理代謝特點加入某種物質(zhì)以達到選擇的目的。例如，培養(yǎng)基中不加入有機物可以選擇培養(yǎng)自養(yǎng)微生物；培養(yǎng)基中不加入氮元素，可以選擇培養(yǎng)能固氮的微生物；加入高濃度的食鹽可選擇培養(yǎng)金黃色葡萄球菌等。統(tǒng)計菌落數(shù)目

（1）測定微生物數(shù)量的常用方法有稀釋涂布平板法和顯微鏡直接計數(shù)。（2）稀釋涂布平板法統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目的原理

當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活細菌。為了保證結(jié)果準確，一般設(shè)置3～5個平板，選擇菌落數(shù)在30～300的平板進行計數(shù)，并取平均值。統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目低，因此，統(tǒng)計結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)來表示。采用此方法的注意事項：1.一般選取菌落數(shù)在30-300之間的平板進行計數(shù)

2.為了防止菌落蔓延，影響計數(shù)，可在培養(yǎng)基中加入TTC（在計數(shù)瓊脂中加入適量的TTC(0.5%TTC1ML加到100ML瓊脂中),細菌菌落長成紅顏色,對去除食品本底顆粒物干擾非常有意義）.3.本法僅限于形成菌落的微生物

設(shè)置對照

設(shè)置對照的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。對照實驗是指除了被測試的條件以外，其他條件都相同的實驗，其作用是比照試驗組，排除任何其他可能原因的干擾，證明確實是所測試的條件引起相應(yīng)的結(jié)果。實驗設(shè)計

實驗設(shè)計包括實驗方案，所需儀器、材料、用具和藥品，具體的實施步驟以及時間安排等的綜合考慮和安排。

（1）土壤取樣：同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物，數(shù)量最大，種類最多。在富含有機質(zhì)的土壤表層，有更多的微生物生長。從富含有機物、潮濕、pH≈7的土壤中取樣。鏟去表層土，在距地表約3～8cm的土壤層取樣。

（2）樣品的稀釋：樣品的稀釋程度將直接影響平板上生長的菌落數(shù)目。在實際操作中，通常選用一定稀釋范圍的樣品液進行培養(yǎng)，以保證獲得菌落數(shù)在30-300之間、適于計數(shù)的平板。測定土壤中細菌的數(shù)量一般選用104

105

106測定放線菌的數(shù)量一般選用10310

4

105測定真菌的數(shù)量一般選用10210310

4

（3）微生物的培養(yǎng)與觀察

不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間。細菌30-37℃1-2天

放線菌25-28℃5-7天霉菌25-28℃3-4天每隔24小時統(tǒng)計一次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，這樣可以防止因培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致一樓菌落的數(shù)目。一般來說，在一定的培養(yǎng)條件下（相同的培養(yǎng)基、溫度及培養(yǎng)時間），同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征。形狀、大小、隆起程度、顏色

疑難解答（1）如何從平板上的菌落數(shù)推測出每克樣品中的菌落數(shù)？統(tǒng)計某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，最好能統(tǒng)計3個平板，計算出平板菌落數(shù)的平均值每克樣品中的菌落數(shù)=（C/V）*M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積（ml），M代表稀釋倍數(shù)

課題三分解纖維素的微生物的分離

纖維素，一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物，是地球上含量最豐富的多糖類物質(zhì)。纖維素與纖維素酶

（1）棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產(chǎn)物，木材、作物秸稈等也富含纖維素。

（2）纖維素酶是一種復(fù)合酶，一般認為它至少包括三種組分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。纖維素最終被水解成葡萄糖，為微生物的生長提供營養(yǎng)。纖維素分解菌的篩選

（1）篩選方法：剛果紅染色法。能夠通過顏色反應(yīng)直接對微生物進行篩選。（2）剛果紅染色法篩選纖維素分解菌的原理

剛果紅是一種染料，它可以與像纖維素這樣的多糖物質(zhì)形成紅色復(fù)合物，但并不和水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。當(dāng)我們在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅時，剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復(fù)合物。當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅－纖維素的復(fù)合物就無法形成，培養(yǎng)基中會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈。這樣，我們就可以通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。

分離分解纖維素的微生物的實驗流程

土壤取樣→選擇培養(yǎng)（此步是否需要，應(yīng)根據(jù)樣品中目的菌株數(shù)量的多少來確定）→梯度稀釋→將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上→挑選產(chǎn)生透明圈的菌落（1）土壤采集選擇富含纖維素的環(huán)境。

（2）剛果紅染色法分離纖維素分解菌的步驟倒平板操作、制備菌懸液、涂布平板（3）剛果紅染色法種類

一種是先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進行顏色反應(yīng)，另一種是在倒平板時就加入剛果紅。課題延伸

對分解纖維素的微生物進行了初步的篩選后，只是分離純化的第一步，為確定得到的是纖維素分解菌，還需要進行發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的實驗，纖維素酶的發(fā)酵方法有液體發(fā)酵和固體發(fā)酵兩種。纖維素酶的測定方法，一般是對纖維素酶分解濾紙等纖維素后所產(chǎn)生的葡萄糖進行定量的測定。

擴展閱讀：新課標選修一生物技術(shù)實踐知識點總結(jié)

生物技術(shù)實踐知識點總結(jié)

專題一傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)的應(yīng)用課題一果酒和果醋的制作

發(fā)酵：通過微生物技術(shù)的培養(yǎng)來生產(chǎn)大量代謝產(chǎn)物的過程。

有氧發(fā)酵：醋酸發(fā)酵谷氨酸發(fā)酵無氧發(fā)酵：酒精發(fā)酵乳酸發(fā)酵

酵母菌是兼性厭氧菌型微生物真菌酵母菌的生殖方式：出芽生殖(主要)分裂生殖孢子生殖在有氧條件下，酵母菌進行有氧呼吸，大量繁殖。C6H12O6＋6O2→6CO2＋6H2O在無氧條件下，酵母菌能進行酒精發(fā)酵。C6H12O6→2C2H5OH＋6CO220℃左右最適宜酵母菌繁殖酒精發(fā)酵時一般將溫度控制在18℃-25℃

在葡萄酒自然發(fā)酵的過程中,起主要作用的是附著在葡萄皮表面的野生型酵母菌.在發(fā)酵過程中,隨著酒精濃度的提高,紅葡萄皮的色素也進入發(fā)酵液,使葡萄酒呈現(xiàn)深紅色.在缺氧呈酸性的發(fā)酵液中，酵母菌可以生長繁殖，而絕大多數(shù)其他微生物都因無法適應(yīng)這一環(huán)境而受到制約。醋酸菌是單細胞細菌(原核生物),代謝類型是異養(yǎng)需氧型,生殖方式為二分裂

當(dāng)氧氣、糖源都充足時，醋酸菌將葡萄汁中的糖分解成醋酸；當(dāng)缺少糖源時，醋酸菌將乙醇變?yōu)橐胰�，再將乙醛變�(yōu)榇姿帷�C2H5OH＋O2→CH3COOH＋H2O

控制發(fā)酵條件的作用①醋酸菌對氧氣的含量特別敏感，當(dāng)進行深層發(fā)酵時，即使只是短時間中斷通入氧氣，也會引起醋酸菌死亡。②醋酸菌最適生長溫度為30～35℃，控制好發(fā)酵溫度，使發(fā)酵時間縮短，又減少雜菌污染的機會。③有兩條途徑生成醋酸：直接氧化和以酒精為底物的氧化。實驗流程：挑選葡萄→沖洗→榨汁→酒精發(fā)酵→果酒（→醋酸發(fā)酵→果醋）

酒精檢驗：果汁發(fā)酵后是否有酒精產(chǎn)生，可以用重鉻酸鉀來檢驗。在酸性條件下，重鉻酸鉀與酒精反應(yīng)呈現(xiàn)灰綠色。先在試管中加入發(fā)酵液2ｍL，再滴入物質(zhì)的量濃度為3mol/L的H2SO43滴，振蕩混勻，最后滴加常溫下飽和的重鉻酸鉀溶液3滴，振蕩試管，觀察顏色

充氣口是在醋酸發(fā)酵時連接充氣泵進行充氣用的；排氣口是在酒精發(fā)酵時用來排出二氧化碳的；出料口是用來取樣的。排氣口要通過一個長而彎曲的膠管與瓶身相連接，其目的是防止空氣中微生物的污染。開口向下的目的是有利于二氧化碳的排出。使用該裝置制酒時，應(yīng)該關(guān)閉充氣口；制醋時，應(yīng)該充氣口連接氣泵，輸入氧氣。

疑難解答

（1）你認為應(yīng)該先沖洗葡萄還是先除去枝梗？為什么？

應(yīng)該先沖洗，然后再除去枝梗，以避免除去枝梗時引起葡萄破損，增加被雜菌污染的機會。（2）你認為應(yīng)該從哪些方面防止發(fā)酵液被污染？

如：要先沖洗葡萄，再除去枝梗；榨汁機、發(fā)酵裝置要清洗干凈，并進行酒精消毒；每次排氣時只需擰松瓶蓋，不要完全揭開瓶蓋等。

（3）制葡萄酒時，為什么要將溫度控制在18～25℃？制葡萄醋時，為什么要將溫度控制在30～35℃？

溫度是酵母菌生長和發(fā)酵的重要條件。20℃左右最適合酵母菌的繁殖。因此需要將溫度控制在其最適溫度范圍內(nèi)。而醋酸菌是嗜溫菌，最適生長溫度為30～35℃，因此要將溫度控制在30～35℃。

課題二腐乳的制作

多種微生物參與了豆腐的發(fā)酵，如青霉、酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。毛霉是一種絲狀真菌。代謝類型是異養(yǎng)需氧型。生殖方式是孢子生殖。營腐生生活。

原理：毛霉等微生物產(chǎn)生的蛋白酶能將豆腐中的蛋白質(zhì)分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可將脂肪水解為甘油和脂肪酸。

實驗流程：讓豆腐上長出毛霉→加鹽腌制→加鹵湯裝瓶→密封腌制釀造腐乳的主要生產(chǎn)工序是將豆腐進行前期發(fā)酵和后期發(fā)酵。

前期發(fā)酵的主要作用：1.創(chuàng)造條件讓毛霉生長。2.使毛酶形成菌膜包住豆腐使腐乳成型。

后期發(fā)酵主要是酶與微生物協(xié)同參與生化反應(yīng)的過程。通過各種輔料與酶的緩解作用，生成腐乳的香氣。

將豆腐切成3cm×3cm×1cm的若干塊。所用豆腐的含水量為70％左右，水分過多則腐乳不易成形。*水分測定方法如下：精確稱取經(jīng)研缽研磨成糊狀的樣品5～10g(精確到0.02mg)，置于已知重量的蒸發(fā)皿中，均勻攤平后，在100～105℃電熱干燥箱內(nèi)干燥4h，取出后置于干燥器內(nèi)冷卻至室溫后稱重，然后再烘30min，直至所稱重量不變?yōu)橹埂?/p>

樣品水分含量（%）計算公式如下：

(烘干前容器和樣品質(zhì)量-烘干后容器和樣品質(zhì)量)/烘干前樣品質(zhì)量

毛霉的生長：條件：將豆腐塊平放在籠屜內(nèi)，將籠屜中的控制在15～18℃，并保持一定的溫度。

來源：1.來自空氣中的毛霉孢子，2.直接接種優(yōu)良毛霉菌種時間：5天

加鹽腌制：將長滿毛霉的豆腐塊分層整齊地擺放在瓶中，同時逐層加鹽，隨著層數(shù)的加高而增加鹽量，接近瓶口表面的鹽要鋪厚一些。加鹽腌制的時間約為8天左右。

用鹽腌制時，注意控制鹽的用量：鹽的濃度過低，不足以抑制微生物的生長，可能導(dǎo)致豆腐腐敗變質(zhì)；鹽的濃度過高會影響腐乳的口味

食鹽的作用：1.抑制微生物的生長，避免腐敗變質(zhì)2.析出水分，是豆腐變硬，在后期制作過程中不易酥爛3.調(diào)味作用，給腐乳以必要的咸味4.浸提毛酶菌絲上的蛋白酶。

配制鹵湯：鹵湯直接關(guān)系到腐乳的色、香、味。鹵湯是由酒及各種香辛料配制而成的。鹵湯中酒的含量一般控制在12%左右。

酒的作用：1.防止雜菌污染以防腐2.與有機酸結(jié)合形成酯，賦予腐乳風(fēng)味3.酒精含量的高低與腐乳后期發(fā)酵時間的長短有很大關(guān)系，酒精含量越高，對蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延長；酒精含量過低，蛋白酶的活性高，加快蛋白質(zhì)的水解，雜菌繁殖快，豆腐易腐敗，難以成塊。香辛料的作用：1.調(diào)味作用2.殺菌防腐作用3.參與并促進發(fā)酵過程

防止雜菌污染：①用來腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干凈后要用沸水消毒。②裝瓶時，操作要迅速小心。整齊地擺放好豆腐、加入鹵湯后，要用膠條將瓶口密封。封瓶時，最好將瓶口通過酒精燈的火焰，防止瓶口被污染。

疑難解答

（1）利用所學(xué)的生物學(xué)知識，解釋豆腐長白毛是怎么一回事？

豆腐生長的白毛是毛霉的白色菌絲。嚴格地說是直立菌絲，在豆腐中還有匍匐菌絲。（2）為什么要撒許多鹽，將長毛的豆腐腌起來？鹽能防止雜菌污染，避免豆腐腐敗。

（3）我們平常吃的豆腐，哪種適合用來做腐乳？

含水量為70%左右的豆腐適于作腐乳。用含水量高的豆腐制作腐乳，不易成形。

（4）吃腐乳時，你會發(fā)現(xiàn)腐乳外部有一層致密的“皮”。這層“皮”是怎樣形成的呢？它對人體有害嗎？它的作用是什么？

“皮”是前期發(fā)酵時在豆腐表面上生長的菌絲（匍匐菌絲），對人體無害。它能形成腐乳的“體”，使腐乳成形。

課題三制作泡菜

制作泡菜所用微生物是乳酸菌，其代謝類型是異養(yǎng)厭氧型。在無氧條件下，降糖分解為乳酸。分裂方式是二分裂。反應(yīng)式為：C6H12O62C3H6O3+能量含抗生素牛奶不能生產(chǎn)酸奶的原因是抗生素殺死乳酸菌。常見的乳酸菌有乳酸鏈球菌和乳酸桿菌。乳酸桿菌常用于生產(chǎn)酸奶。亞硝酸鹽為白色粉末，易溶于水，在食品生產(chǎn)中用作食品添加劑。

膳食中的亞硝酸鹽一般不會危害人體健康，國家規(guī)定肉制品中不超過30mg/kg，醬腌菜中不超過20mg/kg，嬰兒奶粉中不超過2mg/kg。亞硝酸鹽被吸收后隨尿液排出體外，但在適宜pH、溫度和一定微生物作用下形成致癌物質(zhì)亞硝胺。亞一般在腌制10天后亞硝酸鹽含量開始降低，故在10天之后食用最好硝*測定亞硝酸鹽含量的原理是在鹽酸酸化條件下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸酸發(fā)生重氮化反應(yīng)后，與N-1-萘基乙二胺鹽酸鹽結(jié)合形成玫瑰紅色染鹽料，與已知濃度的標準顯色液目測比較，估算泡菜中亞硝酸鹽含量。含量發(fā)酵時間（d）酶

專題二微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用課題一微生物的實驗室培養(yǎng)

培養(yǎng)基：人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)，是進行微生物培養(yǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。

培養(yǎng)基按照物理性質(zhì)可分為液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑瓊脂（是從紅藻中提取的一種多糖，在配制培養(yǎng)基中用作凝固劑）后，制成瓊脂固體培養(yǎng)基。微生物在固體培養(yǎng)基表面生長，可以形成肉眼可見的菌落。根據(jù)菌落的特征可以判斷是哪一種菌。液體培養(yǎng)基應(yīng)用于工業(yè)或生活生產(chǎn)，固體培養(yǎng)基應(yīng)用于微生物的分離和鑒定，半固體培養(yǎng)基則常用于觀察微生物的運動及菌種保藏等。

按照成分培養(yǎng)基可分為人工合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基是用成分已知的化學(xué)物質(zhì)配制而成，其中成分的種類比例明確，常用于微生物的分離鑒定。天然培養(yǎng)基是用化學(xué)成分不明的天然物質(zhì)配制而成，常用于實際工業(yè)生產(chǎn)。

按照培養(yǎng)基的用途，可將培養(yǎng)基分為選擇培養(yǎng)基和鑒定培養(yǎng)基。選擇培養(yǎng)基是指在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物生長，促進所需要的微生物的生長。鑒別培養(yǎng)基是根據(jù)微生物的特點，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品配制而成的，用以鑒別不同類別的微生物。培養(yǎng)基的化學(xué)成分包括水、無機鹽、碳源、氮源、生長因子等。

碳源：能為微生物的代謝提供碳元素的物質(zhì)。如CO2、NaHCO3等無機碳源；糖類、石油、花生粉餅等有機碳源。異養(yǎng)微生物只能利用有機碳源。單質(zhì)碳不能作為碳源。

-+

氮源：能為微生物的代謝提供氮元素的物質(zhì)。如N2、NH3、NO3、NH4（無機氮源）蛋白質(zhì)、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨（有機氮源）等。只有固氮微生物才能利用N2。

培養(yǎng)基還要滿足微生物生長對PH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的要求。例如，培養(yǎng)乳酸桿菌時需要在培養(yǎng)基中添加維生素，培養(yǎng)霉菌時須將培養(yǎng)基的pH調(diào)至酸性，培養(yǎng)細菌是需要將pH調(diào)至中性或微堿性，培養(yǎng)厭氧型微生物是則需要提供無氧的條件

無菌技術(shù)獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止外來雜菌的入侵，要注意以下幾個方面：

①對實驗操作的空間、操作者的衣著和手，進行清潔和消毒。②將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進行滅菌。

③為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實驗操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進行。④實驗操作時應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。

無菌技術(shù)除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？答：無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。消毒與滅菌的區(qū)別

消毒指使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。消毒方法常用煮沸消毒法，巴氏消毒法（對于一些不耐高溫的液體）還有化學(xué)藥劑（如酒精、氯氣、石炭酸等）消毒、紫外線消毒。

滅菌則是指使用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。滅菌方法有灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌。

滅菌方法：

①接種環(huán)、接種針、試管口等使用灼燒滅菌法；②玻璃器皿、金屬用具等使用干熱滅菌法，所用器械是干熱滅菌箱；③培養(yǎng)基、無菌水等使用高壓蒸汽滅菌法，所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋。④表面滅菌和空氣滅菌等使用紫外線滅菌法，所用器械是紫外燈。

比較項理化因素的作用強度消滅微生物的數(shù)量芽孢和孢子能否被消滅消毒滅菌較為溫和強烈部分生活狀態(tài)的微生物全部微生物不能能制作牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（1）方法步驟：計算、稱量、溶化、滅菌、倒平板。（2）倒平板操作的步驟：

①將滅過菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁的桌面上，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手拔出棉塞。②右手拿錐形瓶，將瓶口迅速通過火焰。

③用左手的拇指和食指將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，右手將錐形瓶中的培養(yǎng)基（約10～20mL）倒入培養(yǎng)皿，左手立即蓋上培養(yǎng)皿的皿蓋。

④等待平板冷卻凝固，大約需5～10min。然后，將平板倒過來放置，使培養(yǎng)皿蓋在下、皿底在上。

倒平板操作的討論

1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？

提示：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。

2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？

答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？

答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。

4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？

答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。

純化大腸桿菌

（1）微生物接種的方法最常用的是平板劃線法和稀釋涂布平板法。

（2）平板劃線法是通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作。將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體，這就是菌落。

（3）稀釋涂布平板法是將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進行培養(yǎng)。分為系列稀釋操作和涂布平板操作兩步。

（4）用平板劃線法和稀釋涂布平板法接種的目的是：使聚集在一起的微生物分散成單個細胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落，以便于純化菌種。（5）平板劃線法操作步驟：

①將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)燒紅。②在火焰旁冷卻接種環(huán)，并打開棉塞。③將試管口通過火焰。④將已冷卻的接種環(huán)伸入菌液中蘸取一環(huán)菌液。

⑤將試管通過火焰，并塞上棉塞。⑥左手將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。注意不要劃破培養(yǎng)皿。⑦灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一區(qū)域劃線的末端開始往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復(fù)以上操作，在三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線。注意不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連。⑧將平板倒置放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。平板劃線操作的討論

1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？

答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。

2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。

3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？

答：劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。（6）涂布平板操作的步驟：①將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。②取少量菌液，滴加到培養(yǎng)基表面。③將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃盡后，冷卻8～10s。④用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布平板操作的討論

涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進行無菌操作？

提示：應(yīng)從操作的各個細節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍；等等。

菌種的保存

（1）對于頻繁使用的菌種，可以采用臨時保藏的方法。

①臨時保藏方法

將菌種接種到試管的固體斜面培養(yǎng)基上，在合適的溫度下培養(yǎng)。當(dāng)菌落長成后，將試管放入4℃的冰箱中保藏。以后每3～6個月，都要重新將菌種從舊的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基上。

②缺點：這種方法保存的時間不長，菌種容易被污染或產(chǎn)生變異。（2）對于需要長期保存的菌種，可以采用甘油管藏的方法。

在3mL的甘油瓶中，裝入1mL甘油后滅菌。將1mL培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)移到甘油瓶中，與甘油充分混勻后，放在－20℃的冷凍箱中保存。

疑難解答

（1）生物的營養(yǎng)

營養(yǎng)是指生物攝取、利用營養(yǎng)物質(zhì)的過程。營養(yǎng)物質(zhì)是指維持機體生命活動，保證發(fā)育、生殖所需的外源物質(zhì)。

人及動物的營養(yǎng)物質(zhì)：水、無機鹽、糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、維生素六類。植物的營養(yǎng)物質(zhì)：礦質(zhì)元素、水、二氧化碳等三類。

微生物的營養(yǎng)物質(zhì)：水、無機鹽、碳源、氮源及特殊營養(yǎng)物質(zhì)五類。（2）確定培養(yǎng)基制作是否合格的方法

將未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2天，無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。

課題二土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)

尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥，尿素并不能直接被農(nóng)作物吸收。只有當(dāng)土壤中的細菌將尿素分解成氨之后，才能被植物利用。土壤中的細菌之所以能分解尿素，是因為他們能合成脲酶

尿素最初是從人的尿液中發(fā)現(xiàn)的

篩選菌株

（1）實驗室中微生物的篩選應(yīng)用的原理

人為提供有利于目的菌株生長的條件（包括營養(yǎng)、溫度、pH等），同時抑制或阻止其他微生物生長。

（2）選擇性培養(yǎng)基

在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，稱作選擇培養(yǎng)基。

（3）配制選擇培養(yǎng)基的依據(jù)

根據(jù)選擇培養(yǎng)的菌種的生理代謝特點加入某種物質(zhì)以達到選擇的目的。例如，培養(yǎng)基中不加入有機物可以選擇培養(yǎng)自養(yǎng)微生物；培養(yǎng)基中不加入氮元素，可以選擇培養(yǎng)能固氮的微生物；加入高濃度的食鹽可選擇培養(yǎng)金黃色葡萄球菌等。

統(tǒng)計菌落數(shù)目（1）測定微生物數(shù)量的常用方法有稀釋涂布平板法和顯微鏡直接計數(shù)。（2）稀釋涂布平板法統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目的原理

當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活細菌。為了保證結(jié)果準確，一般設(shè)置3～5個平板，選擇菌落數(shù)在30～300的平板進行計數(shù)，并取平均值。統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目低，因此，統(tǒng)計結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)來表示。

采用此方法的注意事項：1.一般選取菌落數(shù)在30~300之間的平板進行計數(shù)2.為了防止菌落蔓延，影響計數(shù)，可在培養(yǎng)基中加入TTC3.本法僅限于形成菌落的微生物

設(shè)置對照

設(shè)置對照的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響，提高實驗結(jié)果的可信度。對照實驗是指除了被測試的條件以外，其他條件都相同的實驗，其作用是比照試驗組，排除任何其他可能原因的干擾，證明確實是所測試的條件引起相應(yīng)的結(jié)果。

實驗設(shè)計

實驗設(shè)計包括實驗方案，所需儀器、材料、用具和藥品，具體的實施步驟以及時間安排等的綜合考慮和安排。

（1）土壤取樣：同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物，數(shù)量最大，種類最多。在富含有機質(zhì)的土壤表層，有更多的微生物生長。從富含有機物、潮濕、pH≈7的土壤中取樣。鏟去表層土，在距地表約3～8cm的土壤層取樣。

（2）樣品的稀釋：樣品的稀釋程度將直接影響平板上生長的菌落數(shù)目。在實際操作中，通常選用一定稀釋范圍的樣品液進行培養(yǎng)，以保證獲得菌落數(shù)在30~300之間、適于計數(shù)的平板。測定土壤中細菌的數(shù)量，一般選用104105106測定放線菌的數(shù)量，一般選用103104105

測定真菌的數(shù)量，一般選用102103104（3）微生物的培養(yǎng)與觀察

不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間。細菌30~37℃1~2天放線菌25~28℃5~7天霉菌25~28℃3~4天

每隔24小時統(tǒng)計一次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，這樣可以防止因培養(yǎng)時間不足而導(dǎo)致一樓菌落的數(shù)目。一般來說，在一定的培養(yǎng)條件下（相同的培養(yǎng)基、唯獨及培養(yǎng)時間），同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征。形狀、大小、隆起程度、顏色

疑難解答

（1）如何從平板上的菌落數(shù)推測出每克樣品中的菌落數(shù)？

統(tǒng)計某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，最好能統(tǒng)計3個平板，計算出平板菌落數(shù)的平均值

每克樣品中的菌落數(shù)=（C/V）*M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積（ml），M代表稀釋倍數(shù)

課題三分解纖維素的微生物的分離

纖維素，一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物，是地球上含量最豐富的多糖類物質(zhì)。

纖維素與纖維素酶

（1）棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產(chǎn)物，木材、作物秸稈等也富含纖維素。

（2）纖維素酶是一種復(fù)合酶，一般認為它至少包括三種組分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。纖維素最終被水解成葡萄糖，為微生物的生長提供營養(yǎng)。

纖維素分解菌的篩選

（1）篩選方法：剛果紅染色法。能夠通過顏色反應(yīng)直接對微生物進行篩選。（2）剛果紅染色法篩選纖維素分解菌的原理剛果紅是一種染料，它可以與像纖維素這樣的多糖物質(zhì)形成紅色復(fù)合物，但并不和水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。當(dāng)我們在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅時，剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復(fù)合物。當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅－纖維素的復(fù)合物就無法形成，培養(yǎng)基中會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈。這樣，我們就可以通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。

分離分解纖維素的微生物的實驗流程

土壤取樣→選擇培養(yǎng)（此步是否需要，應(yīng)根據(jù)樣品中目的菌株數(shù)量的多少來確定）→梯度稀釋→將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上→挑選產(chǎn)生透明圈的菌落（1）土壤采集選擇富含纖維素的環(huán)境。

（2）剛果紅染色法分離纖維素分解菌的步驟倒平板操作、制備菌懸液、涂布平板（3）剛果紅染色法種類

一種是先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進行顏色反應(yīng)，另一種是在倒平板時就加入剛果紅。

課題延伸

對分解纖維素的微生物進行了初步的篩選后，只是分離純化的第一步，為確定得到的是纖維素分解菌，還需要進行發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的實驗，纖維素酶的發(fā)酵方法有液體發(fā)酵和固體發(fā)酵兩種。纖維素酶的測定方法，一般是對纖維素酶分解濾紙等纖維素后所產(chǎn)生的葡萄糖進行定量的測定。

疑難解答

（1）為什么要在富含纖維素的環(huán)境中尋找纖維素分解菌？

由于生物與環(huán)境的相互依存關(guān)系，在富含纖維素的環(huán)境中，纖維素分解菌的含量相對提高，因此從這種土樣中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。

（2）將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認為濾紙應(yīng)該埋進土壤多深？

將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對聚集，實際上是人工設(shè)置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應(yīng)將紙埋于深約10cm左右腐殖土壤中。（3）兩種剛果紅染色法的比較

方法一是傳統(tǒng)的方法，缺點是操作繁瑣，加入剛果紅溶液會使菌落之間發(fā)生混雜；其優(yōu)點是這樣顯示出的顏色反應(yīng)基本上是纖維素分解菌的作用。方法二的優(yōu)點是操作簡便，不存在菌落混雜問題，缺點是由于纖維素和瓊脂、土豆汁中都含有淀粉類物質(zhì)，可以使能夠產(chǎn)生淀粉酶的微生物出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。但這種只產(chǎn)生淀粉酶的微生物產(chǎn)生的透明圈較為模糊，因為培養(yǎng)基中纖維素占主要地位，因此可以與纖維素酶產(chǎn)生的透明圈相區(qū)分。方法二的另一缺點是：有些微生物具有降解色素的能力，它們在長時間培養(yǎng)過程中會降解剛果紅形成明顯的透明圈，與纖維素分解菌不易區(qū)分。（4）為什么選擇培養(yǎng)能夠“濃縮”所需的微生物？

在選擇培養(yǎng)的條件下，可以使那些能夠適應(yīng)這種營養(yǎng)條件的微生物得到迅速繁殖，而那些不適應(yīng)這種營養(yǎng)條件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“濃縮”的作用。

專題三植物的組織培養(yǎng)技術(shù)課題一菊花的組織培養(yǎng)

植物組織培養(yǎng)的基本過程

細胞分化：在生物個體發(fā)育過程中，細胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生理功能上出現(xiàn)穩(wěn)定性差異的過程。

離體的植物組織或細胞，在培養(yǎng)了一段時間以后，會通過細胞分裂，形成愈傷組織，愈傷組織的細胞排列疏松而無規(guī)則，是一種高度液泡化的呈無定形狀態(tài)的薄壁細胞。由高度分化的植物組織或細胞產(chǎn)生愈傷組織的過程，稱為植物細胞的脫分化，或者叫做去分化。脫分化產(chǎn)生的愈傷組織繼續(xù)進行培養(yǎng)，又可以重新分化成根或芽等器官，這個過程叫做再分化。再分化形成的試管苗，移栽到地里，可以發(fā)育成完整的植物體。植物細胞工程具有某種生物全套遺傳信息的任何一個活細胞，都具有發(fā)育成完整個體的能力，即每個生物細胞都具有全能性。但在生物體的生長發(fā)育過程中并不表現(xiàn)出來，這是因為在特定的時間和空間條件下，通過基因的選擇性表達，構(gòu)成不同組織和器官。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用有：實現(xiàn)優(yōu)良品種的快速繁殖；培育脫毒作物；制作人工種子；培育作物新品種以及細胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)等。

細胞分化是一種持久性的變化，它有什么生理意義？

使多細胞生物體中細胞結(jié)構(gòu)和功能趨向?qū)ｉT化，有利于提高各種生理功能的效率。比較根尖分生組織和愈傷組織的異同組織類型細胞來源細胞形態(tài)細胞結(jié)構(gòu)細胞排列細胞去向根尖分化成多種受精卵正方形無液泡緊密分生組織細胞組織愈傷組織高度分化細胞無定形高度液泡化疏松再分化成新個體相同點都通過有絲分裂進行細胞增殖影響植物組織培養(yǎng)的條件

材料：不同的植物組織，培養(yǎng)的難易程度差別很大。植物材料的選擇直接關(guān)系到試驗的成敗。植物的種類、材料的年齡和保存時間的長短等都會影響實驗結(jié)果。菊花組織培養(yǎng)一般選擇未開花植物的莖上部新萌生的側(cè)枝作材料。一般來說，容易進行無性繁殖的植物容易進行組織培養(yǎng)。選取生長旺盛嫩枝進行組培的是嫩枝生理狀態(tài)好，容易誘導(dǎo)脫分化和再分化。

營養(yǎng)：離體的植物組織和細胞，對營養(yǎng)、環(huán)境等條件的要求相對特殊，需要配制適宜的培養(yǎng)基。常用的培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基，其中含有的大量元素是N、P、S、K、Ca、Mg，微量元素是Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、I、Co，有機物有甘氨酸、煙酸、肌醇、維生素、蔗糖等。

激素：植物激素中生長素和細胞分裂素是啟動細胞分裂、脫分化和再分化的關(guān)鍵性激素。在生長素存在的情況下，細胞分裂素的作用呈現(xiàn)加強趨勢。在培養(yǎng)基中需要添加生長素和細胞分裂素等植物激素，其濃度、使用的先后順序、用量的比例等都影響結(jié)果。生長素／細胞分裂素比值與結(jié)果

使用順序?qū)嶒灲Y(jié)果促根分化，比值高時先生長素，有利于分裂但不分化抑芽形成后細胞分裂素促芽分化，比值低時先細胞分裂素，抑根形成細胞既分裂也分化后生長素比值適中促進愈傷組織生長同時使用分化頻率提高+

環(huán)境條件：PH、溫度、光等環(huán)境條件。

不同的植物對各種條件的要求往往不同。進行菊花的組織培養(yǎng)，一般將pH控制在5.8左右，溫度控制在18~22℃，并且每日用日光燈照射12h.4、操作流程

配制MS固體培養(yǎng)基：配制各種母液：將各種成分按配方比例配制成的濃縮液（培養(yǎng)基母液）。使用時根據(jù)母液的濃縮倍數(shù)，計算用量，并加蒸餾水稀釋。

配制培養(yǎng)基：應(yīng)加入的物質(zhì)有瓊脂、蔗糖、大量元素、微量元素、有機物和植物激素的母液，并用蒸餾水定容到1000毫升。

在菊花組織培養(yǎng)中，可以不添加植物激素

原因是菊花莖段組織培養(yǎng)比較容易。滅菌：采取的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌。

MS培養(yǎng)基中各種營養(yǎng)物質(zhì)的作用是什么？與肉湯培養(yǎng)基相比，MS培養(yǎng)基有哪些特點？

大量元素和微量元素提供植物細胞所必需的無機鹽；蔗糖提供碳源，維持細胞滲透壓；甘氨酸、維生素等物質(zhì)主要是為了滿足離體植物細胞在正常代謝途徑受到一定影響后所產(chǎn)生的特殊營養(yǎng)需求。微生物培養(yǎng)基以有機營養(yǎng)為主，MS培養(yǎng)基則需提供大量無機營養(yǎng)。

外植體的消毒外植體：用于離體培養(yǎng)的植物器官或組織片段。選取菊花莖段時，要取生長旺盛的嫩枝。菊花莖段用流水沖洗后可加少許洗衣粉，用軟刷輕輕刷洗，刷洗后在流水下沖洗20min左右。用無菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入體積分數(shù)為70%的酒精中搖動2~3次，持續(xù)6~7s，立即將外植體取出，在無菌水中清洗。取出后仍用無菌吸水紙吸干外植體表面水分，放入質(zhì)量分數(shù)為0.1%的氯化汞溶液中1~2min。取出后，在無菌水中至少清洗3次，漂洗消毒液。

注意：對外植體進行表面消毒時，就要考慮藥劑的消毒效果，又要考慮植物的耐受能力。

接種：接種過程中插入外植體時形態(tài)學(xué)上端朝上，每個錐形瓶接種7～8個外植體。外植體接種與細菌接種相似，操作步驟相同，而且都要求無菌操作。

培養(yǎng)：應(yīng)該放在無菌箱中進行，并定期進行消毒，保持適宜的溫度（18~22℃）和光照（12h）

移栽：栽前應(yīng)先打開培養(yǎng)瓶的封口膜，讓其在培養(yǎng)間生長幾日，然后用流水清洗根部培養(yǎng)基。然后將幼苗移植到消過毒的蛭石或珍珠巖等環(huán)境中生活一段時間，進行壯苗。最后進行露天栽培。栽培

外植體在培養(yǎng)過程中可能會被污染，原因有外植體消毒不徹底；培養(yǎng)基滅菌不徹底；接種中被雜菌污染；錐形瓶密封性差等。

專題二月季的花藥培養(yǎng)

被子植物的花粉發(fā)育被子植物的雄蕊通常包含花絲、花藥兩部分�；ㄋ帪槟覡罱Y(jié)構(gòu)，內(nèi)部含有許

多花粉�；ǚ凼怯苫ǚ勰讣毎�經(jīng)過減數(shù)分裂而形成的，因此，花粉是單倍體的生殖細胞。被子植物花粉的發(fā)育要經(jīng)歷小孢子四分體時期、單核期和雙核期等階段。在小孢子四分體時期，4個單倍體細胞連在一起，進入單核期時，四分體的4個單倍體細胞彼此分離，形成4個具有單細胞核的花粉粒。這時的細胞含濃厚的原生質(zhì)，核位于細胞的中央（單核居中期）。隨著細胞不斷長大，細胞核由中央移向細胞一側(cè)（單核靠邊期），并分裂成1個生殖細胞核和1個花粉管細胞核，進而形成兩個細胞，一個是生殖細胞，一個是營養(yǎng)細胞。生殖細胞將在分裂一次，形成兩個精子。

注意：①成熟的花粉粒有兩類，一類是二核花粉粒，其花粉粒中只含花粉管細胞核和生殖細胞核，二核花粉粒的精子是在花粉管中形成的；另一類是三核花粉粒，花粉在成熟前，生殖細胞就進行一次有絲分裂，形成兩個精子，此花粉粒中含有兩個精子核和一個花粉管核（營養(yǎng)核）②花粉發(fā)育過程中的四分體和動物細胞減數(shù)分裂的四分體不同�；ǚ郯l(fā)育過程中的四分體是花粉母細胞經(jīng)減數(shù)分裂形成的4個連在一起的單倍體細胞；而動物細胞減數(shù)分裂過程中的四分體是聯(lián)會配對后的一對同源染色體，由于含有四條染色單體而稱為四分體。③同一生殖細胞形成的兩個精子，其基因組成完全相同。

產(chǎn)生花粉植株的兩種途徑通過花藥培養(yǎng)產(chǎn)生花粉植株（即單倍體植株）一般有兩種途徑，一種是

花粉通過胚狀體階段發(fā)育為植物，另一種是花粉在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上先形成愈傷組織，再將其誘導(dǎo)分化成植株。這兩種途徑之間并沒有絕對的界限，主要取決于培養(yǎng)基中激素的種類及其濃度配比。

注意：①無論哪種產(chǎn)生方式，都要先誘導(dǎo)生芽，再誘導(dǎo)生根②胚狀體：植物體細胞組織培養(yǎng)過程中，誘導(dǎo)產(chǎn)生的形態(tài)與受精卵發(fā)育成的胚非常類似的結(jié)構(gòu)，其發(fā)育也與受精卵發(fā)育成的胚類似，有胚芽、胚根、胚軸等完整結(jié)構(gòu)，就像一粒種子，又稱為細胞胚。

影響花藥培養(yǎng)的因素誘導(dǎo)花粉能否成功及誘導(dǎo)成功率的高低，受多種因素影響，其中材料的選擇

與培養(yǎng)基的組成是主要的影響因素

親本的生理狀況：花粉早期是的花藥比后期的更容易產(chǎn)生花粉植株，選擇月季的初花期。

合適的花粉發(fā)育時期：一般來說，在單核期，細胞核由中央移向細胞一側(cè)的時期，花藥培養(yǎng)成功率最高

花蕾：選擇完全未開放的花蕾

親本植株的生長條件、材料的低溫預(yù)處理以及接種密度等對誘導(dǎo)成功率都有一定影響

材料的選取：選擇花藥時，一般要通過鏡檢來確定其中的花粉是否處于適宜的發(fā)育期。確定花粉發(fā)育時期的最常用的方法是醋酸洋紅法。但是，某些植物的花粉細胞核不易著色，需采用焙花青-鉻礬法，這種方法能將花粉細胞核染成藍黑色材料的消毒

接種和培養(yǎng)：滅菌后的花蕾，要在無菌條件下除去萼片和花瓣，并立即將花藥接種到培養(yǎng)基上。在剝離花藥時，要盡量不損傷花藥（否則接種后容易從受傷部位長生愈傷組織），同時還要徹底去除花絲，因為與花絲相連的花藥不利于愈傷組織或胚狀體的形成，通常每瓶接種花藥7～10個,培養(yǎng)溫度控制在25℃左右,不需要光照.幼小植株形成后才需要光照.一般經(jīng)過20～30天培養(yǎng)后,會發(fā)現(xiàn)花藥開裂,長出愈傷組織或形成胚狀體。將愈傷組織及時轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，以便進一步分化出再生植株。如果花藥開裂釋放出胚狀體，則一個花藥內(nèi)就會產(chǎn)生大量幼小植株，必須在花藥開裂后盡快將幼小植株分開，分別移植到新的培養(yǎng)基上，否則這些植株將很難分開。還需要對培養(yǎng)出來的植株做進一步的鑒定和篩選。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)與花藥培養(yǎng)技術(shù)的相同之處是：培養(yǎng)基配制方法、無菌技術(shù)及接種操作等基本相同。兩者的不同之處在于：花藥培養(yǎng)的選材非常重要，需事先摸索時期適宜的花蕾；花藥裂開后釋放出的愈傷組織或胚狀體也要及時更換培養(yǎng)基；花藥培養(yǎng)對培養(yǎng)基配方的要求更為嚴格。這些都使花藥培養(yǎng)的難度大為增加。

專題五ＤＮＡ和蛋白質(zhì)技術(shù)課題一ＤＮＡ的粗提取與鑒定

提取DNA的溶解性原理包括哪些方面？

DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精。

DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度有何特點？要使DNA溶解，需要使用什么濃度？要使DNA析出，又需要使用什么濃度？

在0.14mol/L時溶解度最�。惠^高濃度可使DNA溶解；0.14mol/L可使DNA析出。

在溶解細胞中的DNA時，人們通常選用2mol/LNaCl溶液；將DNA分子析出的方法是向溶有DNA的NaCl溶液中緩慢注入蒸餾水，以稀釋NaCl溶液。酒精是一種常用有機溶劑，但DNA卻不能溶于酒精（特別是95％冷卻酒精），但細胞中蛋白質(zhì)可溶于酒精。

從理論上分析，預(yù)冷的乙醇溶液具有以下優(yōu)點。一是抑制核酸水解酶活性，

防止DNA降解；二是降低分子運動，易于形成沉淀析出；三是低溫有利于增加DNA分子柔韌性，減少斷裂。

采用DNA不溶于酒精的原理，可以達到什么目的？

將DNA和蛋白質(zhì)進一步分離。

提取DNA還可以利用DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性原理。利用該原理時，應(yīng)選用怎樣的酶和怎樣的溫度值？

蛋白酶，因為酶具有專一性，蛋白酶只水解蛋白質(zhì)而不會對DNA產(chǎn)生影響。溫度值為60～80℃，因為該溫度值蛋白質(zhì)變性沉淀，而DNA不會變性。

補充：DNA的變性是指DNA分子在高溫下解螺旋，其溫度在80℃以上，如在PCR技術(shù)中DNA變性溫度在95℃。

洗滌劑在提取DNA中有何作用？

洗滌劑將細胞膜上的蛋白質(zhì)，從而瓦解細胞膜。

當(dāng)鑒定提取出的物質(zhì)是否是DNA時，需要使用什么指示劑進行鑒定？

在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺呈現(xiàn)藍色。

原理總結(jié)：通過利用不同濃度NaCl溶液溶解或析出DNA，可以從細胞中提取和提純DNA；再利用酒精進一步將DNA與蛋白質(zhì)分離開來，達到提純的目的；最后利用二苯胺試劑鑒定提取的物質(zhì)是否是DNA。

實驗材料的選取

不同生物的組織中DNA含量不同。在選取材料時，應(yīng)本著DNA含量高、材料易得、便于提取的原則。

本實驗用雞血細胞做實驗材料有兩個原因。一是因為雞血細胞核的DNA含量豐富，材料易得；二是雞血細胞極易吸水脹破，而用動物肝臟細胞作實驗材料常常需要勻漿和離心，對設(shè)備要求較高，操作繁瑣，歷時較長。

雞血細胞破碎以后釋放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取過程中為了減少DNA的損失，最好使用塑料的燒杯和試管盛放雞血細胞液。破碎細胞，獲取含DNA的濾液

若選用雞血和洋蔥作實驗材料，則怎樣獲取含DNA的濾液？

在雞血細胞液中加入一定量蒸餾水并用玻棒攪拌，過濾后收集濾液；切碎洋蔥，加入一定量洗滌劑和食鹽，攪拌研磨，過濾后收集濾液。為什么加入蒸餾水能使雞血細胞破裂？

答：蒸餾水對于雞血細胞來說是一種低滲液體，水分可以大量進入血細胞內(nèi)，使血細胞脹裂，再加上攪拌的機械作用，就加速了雞血細胞的破裂(細胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA。在以上實驗中，加入蒸餾水、洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？過濾時應(yīng)當(dāng)選用（濾紙、尼龍布）。血細胞在蒸餾水中大量吸水而張裂；洗滌劑瓦解細胞膜；食鹽溶解DNA物質(zhì)；選用尼龍布進行過濾。

在處理植物組織時需要進行研磨，其目的是什么？研磨不充分產(chǎn)生什么結(jié)果？

破碎細胞壁，使核物質(zhì)容易溶解在NaCl溶液中；研磨不充分會使DNA的提取量減少，影響實驗結(jié)果，導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍色等。

。具體做法。10mL雞血＋20mL蒸餾水→同方向攪拌→3層尼龍布過濾→濾液去除濾液中的雜質(zhì)

為什么反復(fù)地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)？

用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過反復(fù)溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)。

最初獲得的DNA濾液含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等雜質(zhì)，需要進一步提純DNA。

方案一的原理是DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白質(zhì)，不分解DNA；方案三的原理是蛋白質(zhì)和DNA的變性溫度不同。

方案二與方案三的原理有什么不同？

答：方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開；方案三利用的是DNA和蛋白質(zhì)對高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離。析出與鑒定

在濾液中仍然含有一些雜質(zhì)，怎樣除去這些雜質(zhì)呢？得到的DNA呈何顏色？

濾液與等體積的冷卻酒精混合均勻，靜置2～3分鐘，析出的白色絲狀物就是DNA。DNA呈白色。怎樣鑒定析出的白色絲狀物就是DNA呢？

具體做法。試管2支，編號甲乙→各加等量5mLNaCl溶液→甲中放入少量白色絲狀物，使之溶解→各加4mL二苯胺，混合均勻→沸水浴5min→觀察顏色變化

實驗操作

制備雞血細胞液加檸檬酸鈉，靜置或離心↓

破碎細胞，釋放DNA加蒸餾水，同一方向快速通方向攪拌↓→過濾，除去細胞壁、細胞膜等。

溶解核內(nèi)DNA加入NaCl至2mol/L，同一方向緩慢攪拌↓

DNA析出加蒸餾水至0.14mol/L，過濾，在溶解到2mol/L溶液中↓→除去細胞質(zhì)中的大部分物質(zhì)。

DNA初步純化與等體積95％冷卻酒精混合，析出白色絲狀物↓→除去核蛋白、RNA、多糖等。

DNA鑒定二苯胺，沸水浴，呈現(xiàn)藍色

注意事項：在雞血中加入檸檬酸鈉防止凝固；雞血靜置或離心以提高細胞懸液濃度；使用塑料燒杯；使用尼龍布過濾；玻棒沿同一方向攪拌；玻棒攪拌要緩慢（細胞破裂快速攪拌）；玻棒不要碰到燒杯壁；二苯胺試劑要現(xiàn)用現(xiàn)配等。

專題六植物有效成分的提取課題一植物芳香油的提取

天然香料的來源：植物、動物不同植物的根、莖、葉、花、果實、種子都可以提取芳香油。芳香油的提取方法：蒸餾、壓榨、萃取等。

芳香油的性質(zhì)：揮發(fā)性強，成分復(fù)雜，以萜類化合物及其衍生物為主。水蒸氣蒸餾法：

原理：水蒸汽可將揮發(fā)性較強的芳香油攜帶出來形成油水混合物，冷卻后水油分層。方法：水中蒸餾：原料放在沸水中加熱蒸餾。

水上蒸餾：原料隔放在沸水上加熱蒸餾。水汽蒸餾：利用外來高溫水蒸氣加熱蒸餾。

不足：有些原料不適宜于水中蒸餾，如柑橘、檸檬等易焦糊，有效成分容易水解。通常用壓榨法（通過機械壓縮力將液相物從液固兩相混合物中分離出來的一種簡單操作）萃取法：

原理：芳香油易溶于有機溶劑，溶劑揮發(fā)后得到芳香油。如石油醚、酒精、乙醚等。方法：原料浸泡在溶劑中→得到浸泡液→有機溶劑揮發(fā)→芳香油。不足：有機溶劑中的雜質(zhì)影響芳香油的品質(zhì)

蒸餾裝置包括：鐵架臺兩個、酒精燈、石棉網(wǎng)、蒸餾瓶、橡膠塞、蒸餾頭、溫度計、直型冷凝管、接液管、錐形瓶，以及連接進水口和出水口的橡皮管。所有儀器必須事先干燥，保證無水。整套蒸餾裝置可分為左、中、右三部分，其中左邊的部分通過加熱進行蒸餾，中部將蒸餾物冷凝，右邊的部分用來接收。安裝儀器一般都按照自下而上、從左到右的順序。拆卸儀器的順序與安裝時相反。具體安裝順序和方法如下。（1）固定熱源──酒精燈。

（2）固定蒸餾瓶，使其離熱源的距離如教科書中圖6-2所示，并且保持蒸餾瓶軸心與鐵架臺的水平面垂直。

（3）安裝蒸餾頭，使蒸餾頭的橫截面與鐵架臺平行。

（4）連接冷凝管。保證上端出水口向上，通過橡皮管與水池相連；下端進水口向下，通過橡皮管與水龍頭相連。

（5）連接接液管（或稱尾接管）。

（6）將接收瓶瓶口對準尾接管的出口。常壓蒸餾一般用錐形瓶而

不用燒杯作接受器，接收瓶應(yīng)在實驗前稱重，并做好記錄。

（7）將溫度計固定在蒸餾頭上，使溫度計水銀球的上限與蒸餾頭側(cè)管的下限處在同一水平線上。

蒸餾裝置安裝完畢后，可以在蒸餾瓶中加幾粒沸石，防止液體過度沸騰。打開水龍頭，緩緩?fù)ㄈ肜渌�，然后開始加熱。加熱時可以觀察到，蒸餾瓶中的液體逐漸沸騰，蒸氣逐漸上升，溫度計讀數(shù)也略有上升。當(dāng)蒸氣的頂端達到溫度計水銀球部位時，溫度計讀數(shù)急劇上升。在整個蒸餾過程中，應(yīng)保證溫度計的水銀球上常有因冷凝作用而形成的液滴�？刂普麴s的時間和速度，通常以每秒1～2滴為宜。

分液漏斗的使用方法如下。

（1）首先把活塞擦干，為活塞均勻涂上一層潤滑脂，注意切勿將潤滑脂涂得太厚或使?jié)櫥�脂進入活塞孔中，以免污染萃取液。

（2）塞好活塞后，把活塞旋轉(zhuǎn)幾圈，使?jié)櫥�脂分布均勻。并用水檢查分液漏斗的頂塞與活塞處是否滲漏，確認不漏水后再使用。

（3）將分液漏斗放置在大小合適的、并已固定在鐵架臺上的鐵圈中，關(guān)好活塞。將待分離的液體從上部開口處倒入漏斗中，塞緊頂塞，注意頂塞不能涂潤滑脂。

（4）取下分液漏斗，用右手手掌頂住漏斗頂塞并握住漏斗頸，左手握住漏斗活塞處，大拇指壓緊活塞，將分液漏斗略傾斜，前后振蕩（開始振蕩時要慢）。

（5）振蕩后，使漏斗口仍保持原傾斜狀態(tài)，左手仍握在漏斗活塞處，下部管口指向無人處，用拇指和食指旋開活塞，使其釋放出漏斗內(nèi)的蒸氣或產(chǎn)生的氣體，以使內(nèi)外壓力平衡，這一步操作也稱做“放氣”。（6）重復(fù)上述操作，直至分液漏斗中只放出很少的氣體時為止。再將分液漏斗劇烈振蕩2～3min，然后將漏斗放回鐵圈中，待液體靜置分層。

蒸餾完畢，應(yīng)先撤出熱源，然后停止通水，最后拆卸蒸餾裝置，拆卸的順序與安裝時相反。玫瑰精油的提取

0.1g/mL氯化鈉溶液：促使油水混合物（乳濁液）中油和水的分離。無水硫酸鈉：吸收油層中的水分。

實驗步驟：①采集玫瑰花：采集盛花期（5月中上旬）的玫瑰花，清水清洗瀝干。

②裝入蒸餾原料：稱取50g玫瑰花放入蒸餾瓶，添加200mL蒸餾水。③安裝蒸餾裝置：按照從左向右、自下到上次序安裝水蒸氣蒸餾裝置。

④加熱蒸餾：控制蒸餾時間和速度（1～2滴/秒），獲得乳白色乳濁液；拆卸裝置。⑤分離油層：向乳濁液加入NaCl溶液后，利用分液漏斗分離出上面的油層。⑥除去水分：向油層中加入無水硫酸鈉，24h后過濾，得到玫瑰油。

＊注意事項：蒸餾時間不能過短，溫度不能過高。橘皮精油的提取

橘皮精油的主要成分：檸檬烯，主要分布在橘皮中。

石灰水：防止壓榨時滑脫，提高出油率，降低壓榨液黏稠度，過濾不堵塞篩眼。小蘇打、硫酸鈉：促進油和水的分離（用量分別為橘皮質(zhì)量的0.25％和5％）。實驗步驟：①橘皮的處理：將新鮮橘皮用清水清洗瀝干。

②石灰水浸泡：用7～8％石灰水浸泡橘皮24h。

③清水漂洗：浸泡好的橘皮用流水徹底漂洗干凈，瀝干。

④粉碎和壓榨：將橘皮粉碎，加入小蘇打和硫酸鈉后，用壓榨機壓榨得到壓榨液。⑤過濾壓榨液：用布袋過濾，濾液再高速離心處理，分離出上層橘皮油。

⑥靜置處理：將橘皮油在5～10℃冰箱中靜置5～7d，分離出上層澄清橘皮油。⑦再次過濾：將下層橘皮油用濾紙過濾，濾液與上層橘皮油合并，得到橘皮精油。

分析：靜置處理目的：除去果蠟和水分。

課題二胡蘿卜素的提取

胡蘿卜素性質(zhì)：橘黃色結(jié)晶，化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定，不溶于水，微溶于乙醇，易溶于石油醚等有機溶劑。

依據(jù)碳碳雙鍵的數(shù)目劃分為α、β、γ三類。其中最主要的組成成分為β-胡蘿卜素。

作用：①治療夜盲癥、幼兒生長發(fā)育不良、干皮癥等疾��；②常用于食品色素；③使癌變細胞恢復(fù)成正常細胞。

提取β－胡蘿卜素的方法主要有三種：①從植物中提�、趶拇竺娣e養(yǎng)殖的巖藻中獲得③利用微生物的發(fā)酵生產(chǎn)

實驗步驟①粉碎：使原料與有機溶劑充分接觸，增大溶解度。②干燥：脫水溫度太高，干燥時間太長會導(dǎo)致胡蘿卜素分解。③萃取

Ⅰ、萃取劑的選擇水溶性的：乙醇、丙酮

水不溶性的：石油醚、乙酸乙酯、乙醚、苯、四氯化碳等

選擇：具有較高的沸點，能夠充分溶解胡蘿卜素，并且不與水混溶。Ⅱ、影響萃取的因素

主要因素：萃取劑的性質(zhì)和使用量

次要因素：原料顆粒的大小、緊密程度、含水量、萃取的溫度和時間等

一般來說，原料顆粒小，萃取溫度高，時間長，需要提取的物質(zhì)就能夠充分溶解，萃取效果就好。萃取前，要將胡蘿卜進行粉碎和干燥Ⅲ、胡蘿卜素提取

裝置的設(shè)計：萃取過程應(yīng)該避免明火加熱，采用水浴加熱，這是因為有機溶劑都是易燃物，直接使用明火加熱容易引起燃燒爆炸。為了防止加熱時有機溶劑揮發(fā)，還要在加熱瓶口安裝回流冷凝裝置。萃取液的濃縮可直接使用蒸餾裝置。在濃縮之前，還要進行過濾，除去萃取液中的不溶物。④過濾：除去萃取液中的不溶物⑤濃縮：蒸發(fā)出有機溶劑鑒定：紙層析法濾紙：18×30

基線：濾紙下端距底邊2處做一基線，在基線上取A、B、C、D四點。

點樣：用最細的注射器針頭（毛細吸管）吸取樣品進行點樣。點樣應(yīng)該快速細致，在基線上形成直徑２ｍｍ左右的圓點，每次點樣后，可用吹風(fēng)機將溶劑吹干，注意保持濾紙干燥。等濾紙上的點樣液自然揮發(fā)干后，將濾紙卷成圓筒狀，至于裝有１ｃｍ深的石油醚的密封玻璃瓶中。等各種色素完全分開后，觀察標準樣品中位于展開劑前沿的胡蘿卜素層析帶。

１．乙醇和丙酮能夠用于胡蘿卜素的萃取嗎？為什么？答：胡蘿卜素可溶于乙醇和丙酮，但它們是水溶性有機溶劑，因萃取中能與水混溶而影響萃取效果，所以不用它們作萃取劑。

2.在石油醚、醋酸乙酯、乙醚、苯和四氯化碳這幾種有機溶劑中，哪種最適宜用來提取胡蘿卜素？答：在這五種有機溶劑中，石油醚的沸點最高，在加熱萃取時不易揮發(fā)，所以石油醚最適宜用作萃取劑。提取方法實驗原理方法步驟適用范圍1.水蒸氣蒸餾水蒸氣利用水蒸氣將揮發(fā)性較強的芳蒸餾香油攜帶出來2.分適用于提取玫瑰油、薄荷油等揮發(fā)性離油層3.除水過濾1.石灰水浸泡、漂洗通過機械加壓，壓榨出果皮中的芳香油靜置3.再次過濾1.粉碎、干燥有機溶使芳香油溶解在有機溶劑中，劑萃取蒸發(fā)溶劑后就可獲得芳香油2.萃適用范圍廣，要求原料的顆粒要盡可取、過濾3.濃縮能細小，能充分浸泡在有機溶液中2.壓適用于柑橘、檸檬等易焦糊原料的提榨、過濾、取強的芳香油壓榨法

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