微生物實(shí)習(xí)報(bào)告

林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院

實(shí)習(xí)報(bào)告

學(xué)生姓名：婁鈞翼學(xué)號(hào)：201*01220327專(zhuān)業(yè)名稱(chēng)：生物科學(xué)微生物班級(jí)：生物科學(xué)102班指導(dǎo)教師：張昕

201*-6-26

一、實(shí)習(xí)目的意義

1、通過(guò)實(shí)習(xí)過(guò)程掌握酸奶中乳酸細(xì)菌的分離純化

2、土壤中自生固N(yùn)菌分離、純化、生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定：通過(guò)實(shí)習(xí)過(guò)程，掌握土壤中微生物的分離、純化和生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定的技術(shù)；

3、參觀臨安青山污水處理廠：參觀污水處理廠，了解其運(yùn)行模式，以及在污水處理過(guò)程中微生物發(fā)揮的作用和技術(shù)；

4、參觀富陽(yáng)海正藥業(yè)有限公司：了解一個(gè)大公司大企業(yè)的運(yùn)行情況，以及專(zhuān)業(yè)方面的一些技術(shù)和應(yīng)用。

二、實(shí)習(xí)地概況

1、第一個(gè)和第二個(gè)實(shí)驗(yàn)是在學(xué)校學(xué)六實(shí)驗(yàn)室完成的；

2、第三個(gè)實(shí)驗(yàn)：臨安市青山污水處理有限公司成立于201*年3月21日，于201*年5月1日投入試運(yùn)行，是一個(gè)集污水收集、處理于一體的公益事業(yè)企業(yè)。公司坐落于浙江省臨安市青山湖街道研口村發(fā)達(dá)畈，占地66畝，近期投資8082萬(wàn)元，建成處理能力2萬(wàn)噸/日，收集管網(wǎng)42公里，工藝采用MSBR法，具有脫氨除磷功能的污水處理設(shè)施。公司堅(jiān)持內(nèi)抓管理強(qiáng)素質(zhì)，外創(chuàng)先進(jìn)塑形象，通過(guò)規(guī)范化、制度化、精細(xì)化、科學(xué)化的管理來(lái)不斷提高污水處理水平，努力提升科學(xué)管理層次，切實(shí)增強(qiáng)企業(yè)核心競(jìng)爭(zhēng)力。公司設(shè)備、工藝先進(jìn)，技術(shù)力量雄厚，現(xiàn)有職工21人，其中技術(shù)人員15人。公司先后通過(guò)了ISO9000和ISO14000質(zhì)量環(huán)境管理體系認(rèn)證及清潔生產(chǎn)認(rèn)證。同時(shí)被評(píng)為浙江省公眾滿(mǎn)意單位杭州市環(huán)境保護(hù)模范企業(yè)、臨安市花園式工廠、臨安市安全聲場(chǎng)先進(jìn)單位、臨安市衛(wèi)生先進(jìn)單位、臨安市綠色企業(yè)等榮譽(yù)稱(chēng)號(hào)。

3、第四個(gè)實(shí)驗(yàn)：占地16000平方米，累計(jì)投資超過(guò)2.6億元，設(shè)有60多個(gè)單元實(shí)驗(yàn)室，集小試、中試與研發(fā)支持為一體。始創(chuàng)于1956年的浙江海正藥業(yè)股份有限公司秉承“執(zhí)著藥物創(chuàng)新，成就健康夢(mèng)想”的使命和“成為廣受尊重的全球化制藥企業(yè)”的愿景，致力于整合藥物研發(fā)與生產(chǎn)資源，為全球客戶(hù)提供更好的產(chǎn)品和服務(wù)，通過(guò)美國(guó)FDA、歐盟EDQM、澳大利亞TGA、韓國(guó)KFDA等官方認(rèn)證的品種達(dá)到40多個(gè)，銷(xiāo)往全球30多個(gè)國(guó)家和地區(qū)。

201*年，公司榮獲“全國(guó)五一勞動(dòng)獎(jiǎng)狀”，海正、HISUN及圖形被認(rèn)定為“中國(guó)馳名商標(biāo)”，入選“中國(guó)萬(wàn)種微生物基因組計(jì)劃”和“國(guó)家重大（磅）級(jí)藥物品種產(chǎn)業(yè)化技術(shù)創(chuàng)新聯(lián)盟”。因圓滿(mǎn)完成“抗甲流藥物中間體生產(chǎn)”的國(guó)家任務(wù)，受到省政府的通令嘉獎(jiǎng)。

201*年，公司入選浙江省醫(yī)藥工業(yè)“十強(qiáng)企業(yè)”，并榮獲“國(guó)內(nèi)最佳產(chǎn)品線(xiàn)十佳工業(yè)企業(yè)”稱(chēng)號(hào)，同時(shí)被譽(yù)為“金蜜蜂獎(jiǎng)成長(zhǎng)型企業(yè)”。

我們主要參觀了海正藥業(yè)在富陽(yáng)的分公司。

三、材料方法

1、材料：乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基、酸奶

原理：當(dāng)乳酸菌生長(zhǎng)代謝出乳酸后，會(huì)是PH下降而使顏色由綠變?yōu)辄S綠，也由于PH

值降低，再加上抗生素及厭氧培養(yǎng)的作用，所以一般的微生物不容易在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。因此十分容易鑒別乳酸菌。

方法：1.1(6月7日)配備乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基(蛋白胨10.0G,牛肉膏10.0G,酵母膏5.0G,

檸檬酸氫二銨2.0G,葡萄糖20.0G,吐溫801.0ML,乙酸鈉5.0G,磷酸氫二鉀2.0G,硫酸鎂0.58G,硫酸錳0.25G,瓊脂18.0G,蒸餾水1000ML,PH6.26.6)

1.2(6月7日)培養(yǎng)基滅菌

1.3(6月8日)用滅菌后冷卻至50攝示度左右的培養(yǎng)基到成平板

1.4(6月8日)用滅菌過(guò)的接種環(huán)挑取酸奶在平板上劃線(xiàn)純化培養(yǎng)4天左右1.5(6月12日)挑取平板上菌落制成臨時(shí)裝片觀察

2、材料：阿須貝無(wú)氮培養(yǎng)基、土壤

方法：2.1(6月12日)配備阿須貝無(wú)氮培養(yǎng)基(葡萄糖10.0G,磷酸氫二鉀0.2G,硫酸

鎂0.2G,氯化鈉0.2G,CaSO4’2H2O;0.1G,碳酸鈣5G,瓊脂18G,蒸餾水1000ML,PH7.2)阿須貝無(wú)氮培養(yǎng)液(葡萄糖10.0G,磷酸氫二鉀0.2G,硫酸鎂0.2G,氯化鈉0.2G,CaSO4’2H2O;0.1G,碳酸鈣5G,蒸餾水1000ML,PH7.2)

2.2(6月12日)培養(yǎng)基,培養(yǎng)液滅菌

2.3(6月12日)用滅菌后冷卻至50攝示度左右的阿須貝無(wú)氮培養(yǎng)基到成平板2.4(6月12日)用滅菌過(guò)的鑷子將黃豆大小的菜園土埋入已冷凝的平板培養(yǎng)基上2.5(6月12日)正面放置28度培養(yǎng)4天

2.6(6月18日)用滅菌過(guò)的接種環(huán)挑取菌苔在新的阿須貝平板上劃線(xiàn)純化32度

培養(yǎng)

2.7(6月20日)單菌落接入液體培養(yǎng)基中于12.24.36.48H后測(cè)吸光值.制備生長(zhǎng)

曲線(xiàn)

四、結(jié)果分析

1.平板上有一個(gè)個(gè)單菌落.在顯微鏡下觀察單菌落就只有一種乳酸菌.酸奶中有保加利亞乳

菌與嗜熱鏈球菌二種.2.

五、實(shí)習(xí)感受

通過(guò)此次實(shí)習(xí)，我學(xué)到了很多課堂上學(xué)不到的東西：親自動(dòng)手配培養(yǎng)基，分離、純化菌類(lèi)，

學(xué)會(huì)使用分光光度計(jì)制作生長(zhǎng)曲線(xiàn)，同時(shí)參觀了一些與微生物緊密相連的公司，了解其運(yùn)行模式、實(shí)踐技術(shù)和應(yīng)用。這讓我清楚地感到了自己肩上的重任，看清了自己的人生方向，也讓我認(rèn)識(shí)到了科研工作應(yīng)支持仔細(xì)認(rèn)真的工作態(tài)度，要有一種平和的心態(tài)和不恥下問(wèn)的精神，不管遇到什么事都要去思考，多聽(tīng)別人的建議，不要太過(guò)急燥，要對(duì)自己所做的事去負(fù)責(zé)，不要輕易地去承諾，承諾了就要努力去兌現(xiàn)。實(shí)習(xí)也培養(yǎng)了我的實(shí)際動(dòng)手能力，增加了實(shí)際的操作經(jīng)驗(yàn)，對(duì)實(shí)際的科研工作的有了一個(gè)新的開(kāi)始，更好地為我們今后的工作積累經(jīng)驗(yàn)。

我知道科研工作是一項(xiàng)需要熱情的事業(yè)，并且要持之以恒的精神和吃苦耐勞的品質(zhì)。我覺(jué)得重要的是在這段實(shí)習(xí)期間里，我第一次真正地接觸了實(shí)驗(yàn)，在實(shí)踐中了解了一些科研技術(shù)，并且在此期間，我參觀了一些公司，也與社會(huì)有所接觸。利用這次難得的機(jī)會(huì)，也打開(kāi)了視野，增長(zhǎng)了見(jiàn)識(shí)，為我們以后進(jìn)一步走向社會(huì)打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

實(shí)習(xí)期間，我從末出現(xiàn)無(wú)故缺勤。我認(rèn)真聽(tīng)取老師的指導(dǎo)，對(duì)于別人提出的實(shí)驗(yàn)建議虛心聽(tīng)取，并能夠仔細(xì)觀察、切身體驗(yàn)、獨(dú)立思考、綜合分析，并努力把學(xué)到的知道應(yīng)用到實(shí)際實(shí)驗(yàn)操作中去，盡力做到理論和實(shí)際相結(jié)合的最佳狀態(tài)，培養(yǎng)了我的耐心和素質(zhì)。

為期兩個(gè)多星期的實(shí)習(xí)結(jié)束了，我在兩個(gè)多星期的實(shí)習(xí)中學(xué)到了很多在課堂上根本就學(xué)不到的知識(shí)，受益匪淺�；叵胱约涸谶@期間的實(shí)習(xí)情況，也有不足之處。對(duì)此我思考過(guò)，學(xué)習(xí)經(jīng)驗(yàn)自然是一個(gè)因素，然而更重要的是心態(tài)的轉(zhuǎn)變沒(méi)有做到位，有些實(shí)驗(yàn)步驟還是停留在應(yīng)付的層面上�，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)了這個(gè)不足之處，應(yīng)該還算是及時(shí)吧，因?yàn)槲颐靼琢撕沃^工作何謂實(shí)際。在接下來(lái)的日子里，我會(huì)朝這個(gè)方向努力，在實(shí)驗(yàn)操作方面我會(huì)更加謹(jǐn)慎。

本次實(shí)習(xí)是我第一次親身感受了所學(xué)知識(shí)與實(shí)際的應(yīng)用，理論與實(shí)際的相結(jié)合，讓我們大開(kāi)眼界，也算是對(duì)以前所學(xué)知識(shí)的一個(gè)初審吧!這次實(shí)習(xí)對(duì)于我們以后學(xué)習(xí)、找工作也真是受益匪淺。我會(huì)把這此實(shí)習(xí)作為我人生的起點(diǎn)，在以后的工作學(xué)習(xí)中不斷要求自己，完善自己，讓自己做的更好。

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一.了解實(shí)驗(yàn)設(shè)備工作及使用方法

潔凈工作臺(tái)

室內(nèi)空氣經(jīng)預(yù)過(guò)濾器和高效除塵后以垂直或水平層流狀態(tài)通過(guò)工作臺(tái)的操作區(qū)，操作臺(tái)保持無(wú)菌狀態(tài)。工作前后，要用紫外線(xiàn)照射15min。使用時(shí)，關(guān)掉紫外燈，打開(kāi)工作燈；用酒精棉球擦手，一切操作都要在酒精燈火焰周?chē)�。高壓蒸汽滅菌�?/p>

立式高壓蒸汽滅菌鍋。一般在0.11MPa的壓力下，121℃滅菌20min。培養(yǎng)箱

恒溫培養(yǎng)箱搖床

氧氣的傳遞較好，培養(yǎng)好養(yǎng)性微生物。

二．菌種分離

（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1．掌握培養(yǎng)基的配方及配置方法。

2．掌握稀釋涂布平板法和分離純化微生物的基本操作技術(shù)。（二）基本原理

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基使一種廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。牛肉膏提供碳源、能源、磷酸鹽和維生素，蛋白胨提供氮源和維生素，NaCl提供無(wú)機(jī)鹽，瓊脂作為凝固劑。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏10g蛋白胨20gNaCl10g瓊脂36g水201*mlpH7.0~7.2

高氏1號(hào)培養(yǎng)基是分離和培養(yǎng)放線(xiàn)菌的合成培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基數(shù)由可溶性淀粉（作為碳源）、KNO3、NaCl、K2PO44H2O、MgSO47H2O（作為微量元素，提供鈉、磷、鎂、硫等離子）和FeSO47H2O（作為微量元素，提供鐵離子）等組成。由于磷酸鹽和鎂鹽相混合時(shí)產(chǎn)生沉淀，因此，在混合培養(yǎng)基成分時(shí)，一般是按配方的順序依次溶解各成分。

高氏1號(hào)培養(yǎng)基可溶性淀粉KNO320gNaCl1gK2PO44H2O0.5gMgSO47H2O0.5gFeSO47H2O0.5g瓊脂20g水1000mlpH7.4~7.6（三）材料

1．溶液或試劑：牛肉膏，蛋白胨，NaCl，瓊脂，1mol/LNaOH,1mol/LHCl，可溶性淀粉，KNO3，K2PO44H2O，MgSO47H2O，F(xiàn)eSO47H2O

2．儀器或其它用具：8個(gè)盛9ml水的試管，2個(gè)盛90ml水的三角瓶，1涂棒，接種環(huán)，7個(gè)培養(yǎng)皿，8個(gè)移液管，一人一個(gè)試管。（四）步驟1．配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（依次加入，瓊脂最后加，配好后測(cè)pH，用緩沖液調(diào)節(jié)pH），然后分裝20個(gè)三角瓶。將配好的高氏1號(hào)培養(yǎng)基加入試管中。

2．把培養(yǎng)基和試管，以及所有的用具都滅菌。在0.11MPa的壓力下，121℃滅菌20min。（水中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定時(shí)用的器材也一起滅菌）。把加入培養(yǎng)基的試管擺好斜面。

3．稀釋涂布平板法

（1）制備菌液在潔凈工作臺(tái)上進(jìn)行。在酒精燈旁邊，吸取10ml菌液注入盛90ml水的三角瓶中，搖勻。

（2）倒平板在潔凈工作臺(tái)上進(jìn)行。方法是右手持盛培養(yǎng)基的三角瓶，置火焰旁邊，左手拿平培養(yǎng)皿（小指和無(wú)名指托住皿底，中指和大拇指卡住皿蓋邊緣，食指放在皿蓋上）。然后左手將培養(yǎng)皿在火焰旁打開(kāi)一縫，迅速倒入培養(yǎng)基至能鋪滿(mǎn)皿底，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)基是培養(yǎng)基均勻分布，至于桌面上。再將三角瓶口的培養(yǎng)基在酒制備稀釋液在酒精燈火焰上燒干。

（3）涂布在潔凈工作臺(tái)上進(jìn)行。等培養(yǎng)基凝固之后，在7個(gè)培養(yǎng)皿上分別標(biāo)出10-1,10-2，10-3，10-4,10-5,10-6,10-7。首先吸取1ml的菌液加入有99ml的三角瓶中搖15min，然后用先滅菌好的裝有9ml無(wú)菌水的試管稀釋?zhuān)ㄓ靡恢б埔汗芟任��?ml的稀釋菌液加入9ml無(wú)菌水的試管中，搖勻，再將稀釋過(guò)的菌液取0.5ml加入培養(yǎng)皿，然后用無(wú)菌涂棒在培養(yǎng)基表面輕輕涂布均勻。（依次類(lèi)推其他梯度）。

（4）培養(yǎng)將涂布好的培養(yǎng)基放置37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24小時(shí)。（5）轉(zhuǎn)移保藏（6月5號(hào)）（五）結(jié)果分析（6月5號(hào)）（六）討論

注意事項(xiàng)：一定要倒置培養(yǎng)，以防培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)的水滴入培養(yǎng)皿，把培養(yǎng)皿中的菌體相互污染。

三．水中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定

（一）目的

1．學(xué)習(xí)水中細(xì)菌總數(shù)測(cè)定方法。2．學(xué)習(xí)稀釋混合平板法（傾注平板法）。（二）原理

傾注平板法測(cè)定水中的菌總數(shù)，以一定培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)出來(lái)的菌落計(jì)算出來(lái)的菌總數(shù)僅是一種近似值。采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。（三）材料

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，5個(gè)培養(yǎng)皿，6支裝有9ml水的試管，5支移液管

（四）步驟

1．滅菌（與上一個(gè)實(shí)驗(yàn)一起滅菌）。

2．與稀釋涂布平板法大部分相同，不同的是，做5個(gè)梯度，10-1,10-2，10-3

，10-4,10-5，并且先吸取每個(gè)梯度的菌液加入培養(yǎng)皿中，然后加入冷卻至45℃

的培養(yǎng)基，搖勻，使樣品中的微生物和培養(yǎng)基充分混合均勻，待冷卻凝成平板后，分別在37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24小時(shí)。（五）結(jié)果分析

在5個(gè)梯度的平板中，只有101的平板上長(zhǎng)出一個(gè)菌落，則1ml水中約有10個(gè)細(xì)菌。（六）討論

1．只有101的平板上長(zhǎng)出一個(gè)菌落，以此計(jì)數(shù)相當(dāng)?shù)牟粶?zhǔn)確，應(yīng)當(dāng)加做實(shí)驗(yàn)再測(cè)定水中細(xì)菌總數(shù)�？梢砸栽�菌液以及2-1，4-1，8-1，16-1為梯度再用稀釋平板法測(cè)定計(jì)數(shù)。

2．應(yīng)當(dāng)取湖泊水或者是河流水，細(xì)菌較多。自來(lái)水已經(jīng)經(jīng)過(guò)消毒滅菌。

四．酵母菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定

（一）目的

1．學(xué)會(huì)制備液體培養(yǎng)基。

2．熟悉并掌握以血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物技術(shù)的基本方法。3．學(xué)會(huì)繪制微生物生長(zhǎng)曲線(xiàn)。（二）原理YPD培養(yǎng)基是適用于實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)酵母菌的液體培養(yǎng)基。酵母膏幫助新酵母菌延滯期的生長(zhǎng)，蛋白胨為微生物提供氮源，葡萄糖為酵母菌復(fù)制繁殖提供營(yíng)養(yǎng)和能量。YPD培養(yǎng)基酵母膏1%蛋白胨2%葡萄糖2%pH5.8~6.2（三）材料

酵母膏，蛋白胨，葡萄糖，三角瓶（每人一個(gè)），5ml移液管，血球計(jì)數(shù)板，酵母菌懸液（四）步驟

1．制備培養(yǎng)基，分裝三角瓶中，每瓶100ml.，用帶有濾紙的封口膜扎口，外加兩層報(bào)紙。

2．滅菌將三角瓶和移液管在0.11MPa的壓力下，121℃滅菌20min。3．接菌在潔凈工作臺(tái)上進(jìn)行。在酒精燈火焰旁，移取5ml酵母菌懸液加入冷卻后的液體培養(yǎng)基中。扎口時(shí)，去掉兩層報(bào)紙，然后，放搖床上37℃恒溫培養(yǎng)。

4．計(jì)數(shù)從接上酵母菌開(kāi)始，第一次測(cè)酵母菌個(gè)數(shù)，此后每過(guò)4小時(shí)測(cè)一次，用血球計(jì)數(shù)板測(cè)，一個(gè)三角瓶測(cè)一次數(shù)據(jù)。如果菌液中個(gè)數(shù)過(guò)多，就用9ml的無(wú)菌水稀釋?zhuān)�再測(cè)。（五）結(jié)果分析（6月6號(hào)）時(shí)間h01.917個(gè)數(shù)×10832時(shí)間個(gè)數(shù)1.35×101043.7×108361.79×101089.1×108401.42×1010123.488×109441.76×1010161.2×109481.32×1010201.63×1010521.8×1010241.32×1010561.92×1010282.62×1010601.1×10lgN1110.5109.598.5801020酵母菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)3040506070時(shí)間（h）

（六）討論

血球計(jì)數(shù)板清洗要干凈，加入血球計(jì)數(shù)板中的菌液不可加過(guò)多，計(jì)數(shù)時(shí)要速度快。

五．菌種形態(tài)學(xué)鑒定及轉(zhuǎn)移保存

（一）目的

1．學(xué)習(xí)描述菌落特征方法。

2．學(xué)習(xí)把細(xì)菌轉(zhuǎn)移保存（從培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至試管）。3．學(xué)習(xí)并掌握革蘭氏顏色和芽孢染色方法。（二）原理

菌落形態(tài)是指某種微生物在一定的培養(yǎng)基上有單菌體形成的群體形態(tài)。每一種微生物在一定的培養(yǎng)條件下形成的菌落個(gè)具有某些相對(duì)的特征，利用觀察這些特征來(lái)區(qū)分各大類(lèi)微生物。

革蘭氏染色原理革蘭氏染色是細(xì)菌分離和鑒定的重要性質(zhì)。染色反應(yīng)呈藍(lán)紫色的成為革蘭氏陽(yáng)性，紅色成為革蘭氏陰性。主要區(qū)別在于細(xì)胞壁，革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁是由肽聚糖形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通透性比較低，在染成紫色后，不容易用酒精脫色，則成藍(lán)紫色。陰性菌相反則成紅色。芽孢染色原理利用細(xì)菌的芽孢和菌體對(duì)染料的親和力不同的原理，用不同燃料進(jìn)行染色，使芽孢和菌體呈現(xiàn)不同的顏色而便于區(qū)分。芽孢壁厚，通透性低，著色脫色均較困難�？兹甘�綠在加熱條件下可以進(jìn)入菌體和芽孢，菌體中的染料經(jīng)水洗脫色，芽孢不易脫色，再用番紅復(fù)染，則菌體和芽孢區(qū)別開(kāi)來(lái)。（三）材料

培養(yǎng)有細(xì)菌的培養(yǎng)皿，裝有培養(yǎng)皿的試管，顯微鏡，載玻片，試管，水浴鍋，孔雀石綠，番紅，酒精，碘液，結(jié)晶紫（四）步驟

1．菌落形態(tài)觀察（1）大小：大、中、小。（2）形態(tài)：圓形、不規(guī)則形。（3）干濕：干燥、濕潤(rùn)、粘稠。（4）高度：扁平、隆起、凹下。（5）透明度：透明、不透明。

（6）顏色：白色、乳白色、黃色、金黃色、綠色、紅色、褐色等。（7）邊緣：整齊、不整齊。2．革蘭氏染色

①初染加結(jié)晶紫一滴，約1~2min，水洗。②媒染滴加碘液沖去殘水，并覆蓋約1min，水洗。

③脫色將玻璃板上的水甩干凈，襯以白背景，用95%酒精滴洗至剛剛不出現(xiàn)藍(lán)色為止，立即用水沖洗。

④復(fù)染用番紅染約1~2min，水洗。

⑤鏡檢干燥后，置油鏡觀察。革蘭氏陽(yáng)性呈紫色，陰性呈紅色，以散開(kāi)的細(xì)菌革蘭氏染色為準(zhǔn)，過(guò)于密集，常常呈現(xiàn)假陽(yáng)性。

3．芽孢染色①滴幾滴蒸餾水于試管中，用接種環(huán)刮取菌落在水中攪拌，之后加入幾滴孔雀石綠，置沸水浴10min。

②然后用接種環(huán)蘸取菌液在載玻片上涂抹，等干燥，過(guò)火兩下固定，水洗至孔雀石綠不再褪色為止。

③用番紅復(fù)染1min。

④待干燥后，置油鏡觀察，芽孢呈綠色，菌體呈紅色。

4．轉(zhuǎn)移保存在潔凈工作臺(tái)上進(jìn)行，在酒精燈火焰旁邊，將找到的菌種挑取一部分，在試管中從底部Z字型畫(huà)線(xiàn)，之后燒一下試管口，棉塞過(guò)火，然后塞住試管。放置37℃恒溫箱中培養(yǎng)。之后放入冰箱中保藏。（五）結(jié)果分析

菌落形態(tài)：中；圓形；濕潤(rùn)；扁平；不透明；白色；邊緣不整齊。顯微鏡觀察：芽孢染色觀察不清楚

革蘭氏染色呈紫色，革蘭氏陽(yáng)性。呈鏈球菌狀

（六）討論

用酒精清洗時(shí)不能時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。但清洗不干凈，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。六．抗性菌株誘變

（一）目的

1．觀察誘變隨微生物的殺菌和誘變雙重生物學(xué)效應(yīng)。2．學(xué)會(huì)用紫外線(xiàn)對(duì)微生物誘變。（二）原理

紫外線(xiàn)輻射能引起DNA鏈的斷裂、DNA內(nèi)分子交聯(lián)，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡或基因突變，其中形成嘧啶二聚體是導(dǎo)致基因突變的主要原因。由于存在光復(fù)活作用，鼓誘變處理及處理后的培養(yǎng)均應(yīng)避免可見(jiàn)光照射（誘變處理應(yīng)在紅光下操作）。通常用照射時(shí)間或細(xì)胞致死率表示相對(duì)計(jì)量。（三）材料

磁力攪拌器，涂布棒，培養(yǎng)皿，移液管，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（四）步驟

1．器材滅菌涂布棒，培養(yǎng)皿，移液管，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，在0.11MPa的壓力下，121℃滅菌20min。

2．菌懸液制備在潔凈工作臺(tái)上進(jìn)行，在酒精燈旁邊，把長(zhǎng)有蠟樣芽胞桿菌菌落的試管移近酒精燈，打開(kāi)瓶塞，把準(zhǔn)備好的生理鹽水打開(kāi)，倒入試管中至淹沒(méi)大半試管中培養(yǎng)基的斜面，然后把裝生理鹽水的瓶放在酒精燈旁，把接種環(huán)灼燒后，貼壁移入試管中，在培養(yǎng)基平面Z字型畫(huà)線(xiàn)，將菌種刮下，盡量不要刮下培養(yǎng)基，然后將試管中水倒入原來(lái)生理鹽水的瓶中，再將生理鹽水倒入試管，之后倒回生理鹽水瓶中。搖勻。菌懸液制成。

3．倒平板在潔凈工作臺(tái)上進(jìn)行，在酒精燈火焰旁，把牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基加入培養(yǎng)皿，并斜置，是培養(yǎng)基在在培養(yǎng)基中成斜面，冷卻后，將20ml青霉素液體加入200ml的培養(yǎng)基的三角瓶中，搖勻，在將此培養(yǎng)基加入培養(yǎng)基中，使與原來(lái)冷卻的培養(yǎng)基同樣高，置于桌面上冷卻。

4．誘變處理取約15ml菌懸液于無(wú)菌培養(yǎng)皿中（內(nèi)置磁棒），打開(kāi)紫外燈，將培養(yǎng)皿放在磁力攪拌器上，開(kāi)啟磁力攪拌器，取下培養(yǎng)皿蓋，開(kāi)始計(jì)時(shí)，分別用5個(gè)培養(yǎng)皿做2min,4min,6min,8min,10min,處理。之后分別將5個(gè)處理的菌液接種在不同的培養(yǎng)皿中，做好標(biāo)簽。用黑紙包好，放置在34℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

5．觀察菌落（五）結(jié)果分析

在誘變時(shí)間為2min,4min,6min分別有細(xì)小菌落出現(xiàn)。8min,10min沒(méi)有菌落出現(xiàn)，導(dǎo)致菌體死亡。（六）討論

可進(jìn)行細(xì)小菌落進(jìn)行在培養(yǎng)，以便觀察其誘變是否產(chǎn)生形態(tài)學(xué)變化。

七．抗生素的效價(jià)測(cè)定

（一）目的

學(xué)習(xí)并掌握牛津杯和濾紙法（管碟二劑量）測(cè)定抗生素的效價(jià)。（二）原理

瓊脂平板擴(kuò)散法來(lái)測(cè)青霉素的效價(jià)。將規(guī)格一定的不銹鋼小管（牛津杯）或?yàn)V紙置于帶菌瓊脂平板上，管中加入抗生素，在室溫條件下擴(kuò)散半個(gè)小時(shí)后放入恒溫箱中培養(yǎng)，在菌體生長(zhǎng)的同時(shí)，被抗生素?cái)U(kuò)散到瓊脂夾板內(nèi)，一直或殺死周?chē)�菌體，從而產(chǎn)生不長(zhǎng)菌的透明抑菌圈。在一定的范圍內(nèi)，抗菌物質(zhì)的濃度（對(duì)數(shù)值）與抑菌圈直徑呈直線(xiàn)關(guān)系。因此，根據(jù)抑菌圈直徑的大小，可以求出相對(duì)應(yīng)的抗菌物質(zhì)的效價(jià)。（三）材料

蠟樣芽孢桿菌菌懸液，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，青霉素（高劑量、低劑量）。不銹鋼小管，濾紙，培養(yǎng)皿，鑷子，直尺，滴管，試管等（四）步驟

1．在潔凈工作臺(tái)上進(jìn)行，在酒精燈火焰旁，先在培養(yǎng)皿中加入一層牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，使覆蓋底部。冷卻后，再將準(zhǔn)備的含有菌體加入培養(yǎng)基，再將含菌培養(yǎng)基加入培養(yǎng)皿。每組做五個(gè)平板。菌液培養(yǎng)基的高度盡量相同。2．將培養(yǎng)皿底部劃線(xiàn)分四部分，牛津杯放在四部分中間，分別加入SH,TH,SL,TL（順時(shí)針）溶液至滿(mǎn)而不溢出�；蛘呤牵�經(jīng)滴有SH,TH,SL,TL溶液的濾紙順時(shí)針?lè)胖糜谂囵B(yǎng)基的四部分中間。放置半小時(shí)后，放入恒溫培養(yǎng)箱中

（五）結(jié)果分析

123平均值(1)求出W和V：

(2)W=（SH+TH）-（SL+TL）=0.87(3)V=（TH+TL）-（SH+SL）=0.63式中：TH：供試品高劑量之抑菌圈直徑TL：供試品低劑量之抑菌圈直徑SH：標(biāo)準(zhǔn)品高劑量之抑菌圈直徑SL：標(biāo)準(zhǔn)品低劑量之抑菌圈直徑

THd(cm)3.53.03.13.2SHd(cm)2.72.92.82.8SLd(cm)2.62.62.72.63TLd(cm)2.42.62.52.求出θ：（2）θ=Dantilog（IV/W）=1×artilog(0.63×lg2/0.87)=－1.51556

θ：供試品和標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)比

D：標(biāo)準(zhǔn)品高劑量與供試品高劑量之比，一般為1I：高低劑量之比的對(duì)數(shù)，即log2或log4。求出Pr：(5)Pr=Ar×θ=－120.925Pr：供試品實(shí)際單位數(shù)Ar：供試品標(biāo)示量或估計(jì)單位（六）討論

這個(gè)實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基制備時(shí)要快，制作均勻，會(huì)減小誤差。

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