《生物化學實驗》教學大綱07應(yīng)化

《生物化學實驗》教學大綱

課程代碼：

課程名稱:生物化學實驗課程類別：職業(yè)技能培訓類修習類別：必修實驗學分：1學分實驗學時：36學時先修課程：生物化學授課對象：應(yīng)用化學

承擔實驗室：實驗樓B508生物化學實驗室

一、教學目標

生物化學實驗的方法和技術(shù)是生物科學以及其他相關(guān)研究領(lǐng)域中的一個非常重要和強有力的工具。通過生物化學實驗這門課程的學習，能使學生掌握生物化學實驗的基本操作及實驗技術(shù)，掌握生物大分子的分離純化、定性、定量、化學性質(zhì)、生物活性的鑒定，掌握和了解組織代謝和能量釋放轉(zhuǎn)變和貯存與代謝調(diào)節(jié)過程中的代謝產(chǎn)物和間產(chǎn)物的定性、定量分析鑒定實驗；學生分析問題和解決問題的能力及實驗動手能力將得到訓練，并能熟練掌握各種生物化學實驗儀器的使用以及準確詳實記錄實驗現(xiàn)象和數(shù)據(jù)的技能。

二、實驗課程基本理論

本門實驗課程以生物化學理論課為基礎(chǔ)，在此基礎(chǔ)上使學生能夠熟練掌握各種常規(guī)的實驗儀器。

三、實驗方式及基本要求

為達到教學目的，實驗指導教師對學生實驗應(yīng)進行的指導：

1、實驗方式：教師講解實驗過程及相關(guān)注意事項，學生自己動手操作，教師全程指導。2、預習要求：應(yīng)與理論課所學習的相應(yīng)部分相結(jié)合，初步了解實驗原理和反應(yīng)過程等。3、實驗操作方面要求：應(yīng)做到規(guī)范、到位，及時觀察與記錄實驗現(xiàn)象和數(shù)據(jù)，并特別強調(diào)

注意事項中設(shè)計的操作，弄清每一步實驗操作的設(shè)計依據(jù)，并深入理解實驗原理和反應(yīng)過程等。

4、實驗報告要求：應(yīng)詳細寫出實驗原理、操作步驟、實驗現(xiàn)象、注意事項，并解答實驗中

要求完成的計算等題目，必要時要總結(jié)實驗成功的收獲或失敗的教訓。

四、教學內(nèi)容及學時分配

序號實驗項目實驗學時4實驗類型演示性實驗內(nèi)容提要介紹并安排常規(guī)玻璃器皿、離心管等實驗儀器的洗滌要求1儀器使用方法與器皿洗滌2蛋白質(zhì)含量的測定3氨基酸的呈色反應(yīng)、蛋白質(zhì)的變性、沉淀和PI測定66綜合性實驗驗證性實驗從小白菜中葉片提取液中測定蛋白質(zhì)含量，采用福林酚法和考馬斯亮藍G-250法通過雙縮脲反應(yīng)、茚三酮證明氨基酸的顏色反應(yīng)，采用重金屬、加熱、調(diào)節(jié)pH值等方式驗證蛋白質(zhì)的變性、復性、沉淀等性質(zhì)并測定其PI。采用微量凱氏定氮法測定雞蛋清的含氮量，從而測定雞蛋清中蛋白質(zhì)的含量。分別測定水果和淀粉中還原糖和總糖的含量并進行比較。采樣稀釋的唾液淀粉酶，通過溫度、pH值等的變化顯示其對酶的活性的影響。4生物物質(zhì)含氮量的測定5還原糖和總糖的測定6DNA的Tm值測定溫度、pH值對酶活性的影響7考試6662設(shè)計性實驗綜合性實驗驗證性實驗

五、考核方式及成績評定

本門課程采用考查方式，各次實驗報告平均分占總成績的70％，實驗操作、考勤、衛(wèi)生值日等占30％。

六、配套教材或指導書

采用自編教材，參考書目如下：

1.《生物化學實驗（第一版）》，陳曾燮等主編，中國科學技術(shù)大學出版社，1994年1月2.《生物化學實驗指導（第一版）》，余冰賓主編，清華大學出版社，201*年1月3.《生物化學技術(shù)原理及其應(yīng)用（第二版）》，趙永芳編著，武漢大學出版社，1994年6月

執(zhí)筆：唐紅楓審閱：

擴展閱讀：生物化學實驗教學大綱201*

《生物化學》實驗教學大綱201*

1、課程屬性：必修2、實驗屬性：非獨立設(shè)課3、學時學分：實驗學時224、實驗應(yīng)開學期：秋季

5、先修課程：有機化學、分析化學、普通化學

一、課程的性質(zhì)與任務(wù)

生物化學實驗課是在學習生物化學理論課的基礎(chǔ)上進行的一個實踐性環(huán)節(jié)，本課程的教學任務(wù)是讓學生運用已學過的知識驗證一些結(jié)論、結(jié)果和現(xiàn)象，及綜合運用已學過的理論知識設(shè)計實驗或進行綜合性的實驗，鞏固和加深對生物化學課程中基本理論知識的理解，訓練學生理論知識的運用能力、實驗操作技能、實驗數(shù)據(jù)的處理和分析能力。

二、實驗目的與基本要求

本實驗課配合理論教學，通過實驗從實踐中進一步學習，掌握和運用學過的基本理論；運用生物化學理論分析實驗過程中的各種現(xiàn)象和問題，培養(yǎng)、訓練學生的分析和解決問題的能力。

學生必須完成的基本要求：準備實驗，預習實驗；寫出預習報告，擬定記錄表格；測取實驗數(shù)據(jù)；整理實驗數(shù)據(jù)；寫出實驗報告。

三、實驗考核方式及辦法

考核方式：考查；實驗成績占總成績的30%，實驗成績評分辦法：實驗操作占40%，實驗態(tài)度占20%，實驗報告占40%。

四、實驗項目一覽表

生物化學實驗項目一覽表

序號

1234567

血清球蛋白的分離--分子篩凝膠層析法醋酸纖維薄膜電泳法分離動物血清蛋白質(zhì)血清乳酸脫氫酶同工酶的分離與測定動物肝臟DNA的提取紫外吸收法測定核酸含量

應(yīng)用紙層析法鑒定酶促轉(zhuǎn)氨基作用維生素C含量的測定

驗證性驗證性綜合性驗證性綜合性綜合性綜合性

必做必做必做必做必做必做必做

農(nóng)科類農(nóng)科類農(nóng)科類農(nóng)科類農(nóng)科類農(nóng)科類農(nóng)科類

4333333

實驗項目名稱

實驗類型

實驗要求

適用專業(yè)

學時五、實驗項目的具體內(nèi)容

實驗一血清球蛋白的分離------分子篩凝膠層析法

1、本次實驗的目的和要求

學習和掌握分子凝膠層析法的原理和技術(shù)（溶脹，裝柱，加樣和洗脫），了解葡聚糖凝膠的選用原則2、實驗內(nèi)容或原理

分子篩指的是一些多孔介質(zhì)。當含有不同大小分子的混合物流經(jīng)這一介質(zhì)時，小分子的物質(zhì)能進入介質(zhì)的孔隙，而大分子的物質(zhì)則被排阻在介質(zhì)之外，從而達到分離的目的，這種作用稱為"分子篩效應(yīng)”。當用含有硫酸銨和球蛋白的混合物進行上樣時，球蛋白最先被吸脫下來，硫酸銨后被吸脫下來，從而達到分離的目的。3、需用的儀器和試劑

層析柱、試管、鐵架臺、恒壓瓶

飽和硫酸銨、10%氫氧化鈉、1%硫酸銅、1%氯化鋇

4、實驗步驟

凝膠的預處理、裝柱、鹽析、上樣收集、鑒定、數(shù)據(jù)處理；5、教學方式

學生為主，教師輔助，充分預習，獨立完成。結(jié)合多媒體幻燈演示6、考核要求

以出勤、隨堂提問、實驗報告和預習報告等平時成績?yōu)橹饕�考核�?nèi)容7、實驗報告要求

實驗報告應(yīng)包括下列各項：（1）報告的題目（要簡明確切）；（2）寫報告人及共同測定人員的姓名；（3）實驗目的；（4）實驗原理；

（5）實驗儀器和試劑（包括主要儀器的規(guī)格、主要試劑的名稱）；（6）實驗數(shù)據(jù)記錄（包括原始數(shù)據(jù)記錄表格和整理后的數(shù)據(jù)記錄表格）；（7實驗結(jié)果。明確提出本次實驗的結(jié)論，用公式計算或用文字說明

（8）分析與討論，要對實驗結(jié)果作出估計，分析誤差大小及原因，對實驗中發(fā)現(xiàn)的問題應(yīng)進行討論，對實驗方法、實驗設(shè)備有何改進建議也可寫入此欄；（9）回答思考題。

實驗二醋酸纖維薄膜電泳法分離動物血清蛋白質(zhì)

1、本次實驗的目的和要求

掌握醋酸纖維薄膜電泳的原理，操作及測定動物蛋白質(zhì)的相對百分含量技術(shù)2、實驗內(nèi)容或原理

蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在pH值大于其等電點的溶液中成為帶負電的陰離子，在電場中移向陽極。血清中的數(shù)種蛋白質(zhì)在同一pH條件下由于其解離狀況不同、，帶點不同，在電場中移動速度不同，采用電泳法可將其分離。醋酸纖維素是纖維素羥基乙�；�形成的纖維素乙酰酯將它溶于有機溶劑后，涂抹成均勻的薄膜待溶劑干后即稱為醋酸纖維薄膜。3、需用的儀器和試劑

水平電泳裝置、培養(yǎng)皿、試管、電泳儀、電泳槽、

0.07mol/L巴比妥-巴比妥鈉緩沖液、氨基黑10B、漂洗液、透明液4、實驗步驟

（1）醋酸纖維薄膜的潤濕和選擇

（2）制作電橋：將緩沖液倒入電泳槽中，根據(jù)電泳槽的縱向尺寸，于兩極支架上各放入三層濾紙，濾紙的一端與支架的前端對齊，另一點進入緩沖液中，除去氣泡使濾紙緊貼于支架上，即為紙濾橋。

（3）點樣：無光澤面朝上，在距負端1.5cm處，蓋玻片點樣注意點樣時應(yīng)使血清均勻的分布在點樣區(qū)形成有一定寬度粗細均勻的直線，這是獲得重要清晰區(qū)帶電泳圖譜的重要環(huán)節(jié)之一�？墒孪仍跒V紙上練習點樣。

（4）電泳：將點好樣的薄膜無光澤面向下，兩端貼在電泳槽支架的濾紙上，點樣端在負極。平衡10min，調(diào)電壓最大，然后調(diào)電流，0.6mA/條，預電泳10min，調(diào)電流1mA/條，電泳45min關(guān)閉電源.注意電泳過程中防止電壓偏高或偏低.

（5）電泳完畢，取出薄膜直接浸入染色液(.氨基黑10B)中，染色五分鐘（6）漂洗：漂洗液漂洗直至背景染色脫去呈白色，可看出清晰的五條區(qū)帶.

（7）記錄：由正極依次為清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白。記下遷移距離。

（8）透明：甲液2min，乙液1min，寧缺毋濫。取出薄膜貼于載玻片上放置于陰涼處晾干備用

5、教學方式

學生為主，教師輔助，充分預習，獨立完成。6、考核要求

同上7、實驗報告要求

實驗報告應(yīng)包括下列各項：（1）報告的題目（要簡明確切）；（2）寫報告人及共同測定人員的姓名；（3）實驗目的；（4）實驗原理；

（5）實驗儀器和試劑（包括主要儀器的規(guī)格、主要試劑的名稱）；（6）實驗數(shù)據(jù)記錄（包括原始數(shù)據(jù)記錄表格和整理后的數(shù)據(jù)記錄表格）；（7實驗結(jié)果。明確提出本次實驗的結(jié)論，用文字說明（8）分析與討論，要對實驗結(jié)果作出估計，分析誤差大小及原因，對實驗中發(fā)現(xiàn)的問題應(yīng)進行討論，對實驗方法、實驗設(shè)備有何改進建議也可寫入此欄；（9）回答思考題。

實驗三血清乳酸脫氫酶同工酶的分離與測定

（聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳法）

1、本次實驗的目的和要求

掌握盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理。學習盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作技術(shù)，包括制膠、灌膠、加樣、電泳、剝膠、染色及脫色等。學會用盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳分離同工酶。

2、實驗內(nèi)容或原理

聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺單體和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺，在加速劑和催化劑的作用下聚合而成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。血清樣品中含有5種同工酶，在同一pH條件下，解離狀況不同，通過聚丙烯酰胺凝膠具有的濃縮效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)將五種同工酶分離。3、需用的儀器和試劑

離心機、中壓電泳儀，電泳槽、注射器、玻璃管、加樣器、

丙烯酰胺貯液、過硫酸銨、蔗糖、核黃素、乳酸鈉、輔酶I、PMS、NBT4、實驗步驟

（1）貯液及制備（分離膠每份15ml，濃縮膠每份5ml，可供60人使用）

（2）制膠：用注射器在玻璃管管底加入3-4滴蔗糖→加樣器加膠至管高2/3處→加1cm重蒸水水封→放到水浴鍋的試管架上聚合→除去上層水封→加入1cm大孔膠→加1cm重蒸水水封置于燈管下→聚合至凝膠呈乳白色。

（3）安裝：將卸掉皮筋、膠帽、乳膠管的玻璃管裝入圓盤電泳槽中，排出管兩端的氣泡。（4）上樣：樣品組成為：兔血清+40%蔗糖+0.1%溴酚藍（體積比1：1：1）。上樣80μl。（5）電泳：上槽連接負極，下槽連接正極。開始時調(diào)節(jié)電流2mA/管，3min后調(diào)節(jié)電流4mA/管。電泳時間根據(jù)指示劑染料的遷移來決定，當溴酚藍指示劑接近凝膠底部1cm時停止電泳。

（6）剝膠：用注射器吸滿水，從濃縮膠的一端小心的插入到管壁與凝膠之間，轉(zhuǎn)動玻璃管同時推動注射器，靠水流的壓力和潤滑作用將玻璃管與凝膠分開，最終使凝膠從玻璃管中脫落。

（7）．染色：避光37℃保溫10-30min，凝膠條上可顯示出紫色的LDH帶。從正極依次為LDH1（H4）、LDH2（H3M）、LDH3（H2M2）、LDH4（HM3）、LDH5（M4）（其中LDH4和LDH5含量較少）

（8）．計算相對遷移率：

相對遷移率=點樣點到各帶的距離/點樣點到染料的距離（9）．染色的固定：將凝膠條放入7%醋酸中脫色和固定。5、教學方式

學生為主，教師輔助，充分預習，獨立完成。6、考核要求

考核要求同上。7、實驗報告要求

實驗報告要求同上。

實驗四動物肝臟DNA的提取

1、本次實驗的目的和要求

了解DNA和RNA的不同溶解性質(zhì)。學習用鹽溶液法從動物組織中提取DNA的原理和操作技術(shù)2、實驗內(nèi)容或原理

核酸和蛋白質(zhì)時構(gòu)成生物有機體的主要成分，在生物體內(nèi)核酸通常是與蛋白質(zhì)結(jié)合成核帶白的形式存在，核蛋白有脫氧核糖核蛋白和核糖核蛋白。在濃的NaCl溶液中，脫氧核糖核蛋白溶解度更大，核糖核蛋白溶解度很小，而在稀的NaCl溶液中，脫氧核糖核蛋白溶解度很小，而核糖核蛋白溶解度很大，因此可利用不同濃度的NaCl溶液將核糖核蛋白和脫氧核糖核蛋白從樣品中分別提取出來.經(jīng)提取到的核蛋白用SDS處理，會引起蛋白變性而與DNA分開，氯仿—異戊醇可將蛋白沉淀除去，DNA則溶解于溶液中。向溶液中加入適量的冷乙醇，DNA即析出。.3、需用的儀器和試劑

試劑：0.1MNACL-0.05M檸檬酸鈉混合液，5MNaCl，25%SDS，氯仿異戊醇，

95%冷乙醇。

儀器：小燒杯、玻璃棒、大滴管、量筒、離心杯套筒、勻漿器、小天平、稱量紙。4、實驗步驟

(1)細胞的破碎：取8g新鮮的動物內(nèi)臟，用15ml0.1MNaCl-0.05M檸檬酸鈉混合液放入勻漿器中研磨，然后倒出勻漿，4000rpm離心10min，棄去上清液。

(2)洗滌：向沉淀中加入10ml0.1MNaCl-0.05M檸檬酸鈉混合液，玻璃棒攪拌，4000rpm離心，10min，倒掉上清液。

(3)蛋白質(zhì)變性：向沉淀中加入10ml0.1MNaCl-0.05M檸檬酸鈉混合液，混勻后加入8滴SDS60℃水浴保溫10min，此步的目的是使DNA與蛋白質(zhì)分離。(4)DNA溶解：稍冷加入5MNaCl溶液2ml，攪拌10min。

(5)蛋白質(zhì)沉淀：加等體積的氯仿—異戊醇，震蕩20min，4000rpm離心10min，離心杯中出現(xiàn)三層，上層為含DNA和殘留的DNA核蛋白的水層，中層為變性蛋白質(zhì)凝膠，下層是氯仿—異戊醇的有機相層。

(6)DNA析出：吸出上層的水相，慢慢加入95%冷乙醇，用玻璃棒攪出絲狀的DNA，晾干即為DNA實驗產(chǎn)品。5、教學方式學生為主，教師輔助，充分預習，獨立完成。6、考核要求

同上基本考核要求。7、實驗報告要求

同上實驗報告要求

實驗五紫外吸收法測定核酸含量

1、本次實驗的目的和要求

學習紫外分光光度法測定核酸含量的原理和操作方法，熟悉紫外分光光度計的基本原理和使用方法2、實驗內(nèi)容或原理

DNA和RNA都具有紫外吸收的性質(zhì)，它們的紫外吸收高峰在260nm處。其紫外吸收特性是由于它們含有的嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)的共軛雙鍵系統(tǒng)的特性所決定的。每毫升溶液含1μgDNA鈉鹽的光吸收值為0.020，因此在260nm處測的未知樣的光吸收值即可求出其含量。

3、需用的儀器和試劑

試管、紫外分光光度計、水浴鍋晾干的DNA粗制品，蒸餾水4、實驗步驟

（1）用蓋玻片刮取1mgDNA粗制品，溶于10倍體積的蒸餾水中。

(2)在260nm波長下，以蒸餾水作參照，在紫外分光光度計上測定其吸收值。5、教學方式

學生為主，教師輔助，充分預習，獨立完成。6、考核要求

考核要求同上。7、實驗報告要求

實驗報告要求同上。

實驗六應(yīng)用紙層析法鑒定酶促轉(zhuǎn)氨基作用

1、本次實驗的目的和要求

轉(zhuǎn)氨基作用是動植物界普遍存在的一種生化反應(yīng)，研究動植物體的轉(zhuǎn)氨基作用可以了解動植物體不同發(fā)育階段代謝動態(tài)的一個側(cè)面，從而研究控制其代謝途徑。2、實驗內(nèi)容或原理

由轉(zhuǎn)氨酶催化，經(jīng)轉(zhuǎn)氨基后，原來氨基酸上的氨基轉(zhuǎn)移到酮酸的相應(yīng)位置上，形成新的另外一個氨基酸和酮酸，可在濾紙上進行層析并被茚三酮溶液檢出。3、需用的儀器和試劑

勻漿器、培養(yǎng)皿、試管、毛細血管、吹風機、

0.01mil/L磷酸緩沖液，丙氨酸，α-酮戊二酸，飽和苯酚4、實驗步驟

（1）肌肉靡的制作：取新鮮魚肉糜100g，加入100ml0.01mol/L磷酸緩沖液(pH7.4)，用勻漿器制成勻漿備用。

（2）酶促反應(yīng)：管號試劑0.1mol/L丙氨酸(ml)0.1mol/Lα-酮戊二酸(ml)肌肉靡(ml)1.01.02.01.01.02.0對照管測定管對照管加入肌肉靡后立即煮沸10min，而后放入37℃水浴中保溫30min，測定管37℃保溫30min后，立即于沸水浴中加熱10min終止反應(yīng)。冷卻后將二管分別過濾2滴到載玻片上待用。

（3）．點樣：取層析紙一張，找出圓心。通過圓心作垂直線，在2條垂直線上于圓心相

丙0．5cm測谷對照距0.5cm處，分別作為測定管和對照管及標準丙氨酸，谷氨酸的點樣位置如圖所示。點樣時將毛細管口輕輕點在濾紙上，使斑點直徑3mm，重復三次，每次待完全干燥后再點下一次。

（4）展層：點樣前在層析紙的圓心處打一小洞，取一小層析紙條，剪成刷狀，卷成燈芯狀，插入小孔內(nèi)，使毛刷朝下，點樣面朝上平放在盛有飽和苯酚的培養(yǎng)皿中，上面蓋上合適的培養(yǎng)皿。大約45min待溶劑前沿達到培養(yǎng)皿邊緣小于1cm處，取出層析紙，記下溶劑前沿去掉紙芯用吹風機吹干層析紙。

（5）顯色：用噴霧器向?qū)游黾埦鶆驀姙?.1%茚三酮溶液，吹風機吹干，層析紙上可看到紫色的斑點，比較色斑的位置及色的深淺記錄點樣點到色斑的距離及到點樣點到溶劑前沿的距離。

（6）計算每個樣點的Rf值

Rf=點樣點到色斑的距離/點樣點到溶劑前沿的距離5、教學方式

學生為主，教師輔助，充分預習，獨立完成。6、考核要求

同上基本考核要求。7、實驗報告要求

要求同上

六、實驗教材及主要參考資料

劉祥云，張云貴，李天俊主編，《生物化學實驗指導》，201*年李建武等主編，《生物化學實驗原理和方法》，1994年趙永芳主編，《生物化學技術(shù)原理及應(yīng)用》，201*年

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