細胞生物學(xué)實驗報告

細胞生物學(xué)實驗報告

細胞生物學(xué)實驗報告

動物細胞融合

【實驗?zāi)康摹?/p>

⒈了解動物細胞融合的常用方法。⒉學(xué)習(xí)化學(xué)融合的基本操作過程。

⒊觀察動物細胞融合過程中細胞的行為和變化。

【實驗原理】

細胞融合是指在自發(fā)或者誘導(dǎo)條件下，兩個或兩個以上細胞合并為雙核或者多核細胞的過程。目前人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有很多方法可以誘導(dǎo)細胞融合，包括病毒誘導(dǎo)融合、化學(xué)誘導(dǎo)融合和電激誘導(dǎo)融合。

⒈病毒誘導(dǎo)融合

仙臺病毒、牛痘病毒、新城雞瘟病毒和皰疹病毒等可以介導(dǎo)細胞的融合。這類病毒的被膜中含有融合蛋白，可介導(dǎo)病毒和宿主細胞融合，同時也可介導(dǎo)細胞與細胞的融合。用紫外線滅活后，這些病毒即可誘導(dǎo)細胞發(fā)生融合。

⒉化學(xué)誘導(dǎo)融合

很多化學(xué)試劑能夠誘導(dǎo)細胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亞砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰絲氨酸等。這些物質(zhì)能夠改變細胞膜脂質(zhì)分子的排列，在去除這些物質(zhì)之后，細胞膜趨向于恢復(fù)原有的有序結(jié)構(gòu)。在恢復(fù)過程中相接觸的細胞由于接口處脂質(zhì)雙分子層的相互親和與表面張力，細胞膜融合，胞質(zhì)流通，發(fā)生融合�；瘜W(xué)誘導(dǎo)方法，操作方便，誘導(dǎo)融合的概率比較高，效果穩(wěn)定，適用于動、植物細胞，但對細胞具有一定的毒性。PEG是被廣泛使用的化學(xué)融合劑。

⒊電激誘導(dǎo)融合

包括電誘導(dǎo)、激光誘導(dǎo)等。其中，電誘導(dǎo)是先使細胞在電場中極化成為偶極子，沿電力線排布成串，再利用高強度、短時程的電脈沖擊破細胞膜，細胞膜的脂質(zhì)分子發(fā)生重排，由于表面張力的作用，兩細胞發(fā)生融合。電誘導(dǎo)方法具有融合過程易控制、融合概率高、無毒性、作用機制明確、可重復(fù)性高等優(yōu)點。

【實驗用品】

⒈材料

雞血紅細胞。⒉試劑

50%PEG、Hank’s溶液(pH7.4)、Alsever’s細胞保存液、0.85%氯化鈉溶液。⒊器材

正置顯微鏡、離心機、離心管、載玻片、蓋玻片、滴管、注射器等。

【實驗步驟】

⒈雞血紅細胞的制備和保存

用無菌注射器先吸入Alsevers溶液1ml，再從雞翼下靜脈取血0.5~1ml，取出后放入刻度離心管中，再加入2~3mlAlsevers溶液，使總量為4~5ml，混勻并封口，置于4℃冰箱內(nèi)。

⒉PEG誘導(dǎo)融合

⑴取保存的雞血，離心去除Alsevers溶液，以0.85%氯化鈉溶液配制成5%~10%的懸液。

⑵稱取1gPEG放入試管內(nèi)，在沸水浴中融化后，加入1ml預(yù)熱的Hank’s溶液，混勻，制成50%的PEG溶液。放入37℃水浴中待用。

⑶取上述雞紅細胞懸液1ml放入離心管中，再加入5mlHank’s溶液混勻，然后以1000r/min離心5min，小心棄去上清液，用指彈法將細胞團塊彈散。

⑷取上述50%PEG溶液1ml，在1min內(nèi)滴加到雞紅細胞懸液中，邊加邊輕輕搖動混勻。待PEG全部加入后靜置2~5min左右。

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⑸緩慢滴加6mlHank’s溶液以終止PEG的作用，混勻，靜置5min。

⑹1000r/min離心3min，棄上清液后，取一滴融合后的細胞懸液滴片，加蓋玻片鏡檢。

【實驗結(jié)果】

【分析與討論】

⒈結(jié)果分析

視野中有部分細胞出現(xiàn)融合現(xiàn)象，但是沒有觀察到細胞核。此外，視野中有些細胞發(fā)生重疊，是由于稀釋不足造成的。

⒉注意事項

⑴制備的雞血紅細胞懸液的濃度不宜過高，否則細胞容易聚集，融合效果受影響。

⑵在離心之前，為了防止損壞儀器，應(yīng)配平離心機。具體方法為：把相對的兩個皮套放在天平上秤，在皮套中央各放置一個空的離心管，通過調(diào)節(jié)離心管中水的量來使天平達到平衡。

⑶在制片之前，應(yīng)對細胞懸液進行充分稀釋，以免細胞發(fā)生重疊，影響觀察。⑷在制片之后，如雞血紅細胞懸液過多，則應(yīng)用吸水紙吸去，以免弄臟物鏡。⑸為了觀察清楚，應(yīng)把光線調(diào)暗，并改用小光圈。

【相關(guān)鏈接】

細胞融合技術(shù)的應(yīng)用

⒈植物體細胞雜交

植物體細胞雜交（plantsomatic

hybridization）,又稱原生質(zhì)體融合（Protoplastfusion）是指將植物不同種、屬，甚至科間的原生質(zhì)體通過人工方法誘導(dǎo)融合，然后進行離

體培養(yǎng)，使其再生雜種植株的技術(shù)。植物細胞具有細胞壁，未脫壁的兩個細胞是很難融合的，植物細胞只有在脫去細胞壁成為原生質(zhì)體后才能融合，所以植物的細胞融合也稱為原生質(zhì)體融合。

⒉單克隆抗體

單克隆抗體是由淋巴細胞雜交瘤產(chǎn)生的、只針對復(fù)合抗原分子上某一單個抗原決定簇的特異性抗體。淋巴細胞雜交瘤是用人工方法使骨髓瘤細胞（純系小鼠的腹水瘤型漿細胞）與已用抗原致敏并能分泌某種

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抗體的淋巴細胞（常用致敏動物的脾細胞，起作用的是其中的B細胞）融合而成的。用來使上述淋巴細胞致敏的抗原有人和動物的T細胞、B細胞、紅細胞、腫瘤細胞、各種微生物或其他抗原物質(zhì)等。這種融合細胞既具有腫瘤細胞能大量、無限繁殖的特性，又具有B細胞能合成分泌特異性抗體的能力。由于一個B細胞克隆只針對一個

抗原決定簇產(chǎn)生相對應(yīng)的抗體，所以一個B細胞與骨髓瘤細胞融合而成的單個雜交瘤細胞，也只產(chǎn)生某種單一的抗體。采用適當方法把雜交瘤細胞分離出來，進行單個細胞培養(yǎng)，使之大量繁殖，則在該培養(yǎng)液中增殖而形成的細胞克隆，只產(chǎn)生完全均一的、單一特異性的抗體，即單克隆抗體。若把能產(chǎn)生特異性抗體的單克隆雜交瘤進行大量培養(yǎng)，或注入原系動物腹腔中，則雜交瘤仍以腹水型方式生長，在培養(yǎng)液或腹水中會含有大量單克隆抗體。用雜交瘤技術(shù)制備出來的單克隆抗體純度高、專一性強、效價高，使用時可免除不同細胞及微生物種或株間血清學(xué)上的交叉反應(yīng)，大大提高了診斷的特異性及敏感性。另外，在研究細胞表面標志、提純可溶性抗原、進一步研究抗體的結(jié)構(gòu)和功能等方面都起著十分重要的作用。

⒊細胞治療

將自體細胞取出，經(jīng)培養(yǎng)3-5周后再移植（注射）到自體的病患部位，達到替代受損細胞修復(fù)之目的，細胞治療有長期的效果，細胞能釋放自身的愈合和再生能力，治療疾�。�腫瘤；臟器；器官；疤痕；皺紋;皮膚化等）。

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⒋核移植

核移植是將供體細胞核移入去核的卵母細胞中，使后者不經(jīng)精子穿透等有性過程即可被激活、分裂并發(fā)育，讓核供體的基因得到完全復(fù)制。培養(yǎng)一段時間后，在把發(fā)育中的卵母細胞移植到人或動

物體內(nèi)的方法。核移植的細胞來源主要分為：供體細胞來源和受體細胞的來源兩種。核移植主要用于細胞移植和異種器官移植，細胞移植可以治療由于細胞功能缺陷所引的各種疾病。

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